1.一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测的引物和探针,其特征在于,所述引物和探针包括:牦牛轮状病毒上游引物和牦牛轮状病毒下游引物和牦牛轮状病毒探针,其中,
所述牦牛轮状病毒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述牦牛轮状病毒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述牦牛轮状病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;牦牛轮状病毒探针的核苷酸序列的5'端连接有FAM标记,3'端连接有非荧光淬灭基团和BHQ。
2.权利要求1所述的引物和探针在制备牦牛轮状病毒检测试剂盒方面的应用。
3.一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒,其特征在于,包括反应缓冲液、荧光定量PCR反应液冻干管、阳性对照品冻干管和阴性对照品冻干管;
所述荧光定量PCR反应液冻干管包括Taq酶1μL、反转录酶1.25μL、牦牛轮状病毒上游引物、牦牛轮状病毒下游引物各3.5μL和牦牛轮状病毒探针0.25μL、dNTPs 4μL;
牦牛轮状病毒上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;所述牦牛轮状病毒下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述牦牛轮状病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;牦牛轮状病毒探针的核苷酸序列的5'端连接有FAM标记,3'端连接有非荧光淬灭基团和BHQ。
4.根据权利要求3所述的基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒,其特征在于,所述Taq酶的终浓度为5U·μL-1,反转录酶的终浓度为20U·μL-1,牦牛轮状病毒上游引物和牦牛轮状病毒下游引物的终浓度均为10μmol·μL-1,牦牛轮状病毒探针的终浓度为10μmol·μL-1,dNTPs的终浓度为2.5mM。
5.根据权利要求3或4所述的基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒,其特征在于,所述荧光定量PCR反应液冻干管通过以下方法制备得到:将权利要求3或4所述的Taq酶、反转录酶、牦牛轮状病毒上游引物、牦牛轮状病毒下游引物和牦牛轮状病毒探针、dNTPs混合加入0.5ml的PCR管中降至-50℃,然后在10pa气压下冻干24h,形成干粉状后闭管,制得荧光定量PCR反应液冻干管。
6.根据权利要求5所述的基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒,其特征在于,所述荧光定量PCR反应液冻干管设置有50管。
7.根据权利要求3所述的基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒,其特征在于,所述反应缓冲液由以下组分构成:500mM KCl、pH 8.3、100mM Tris-HCl、15mM MgCl2,余量为ddH2O,以上体积总量为3ml。
8.根据权利要求3所述的基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒,其特征在于,阳性对照品冻干管通过以下方法制备得到:将含有牦牛轮状病毒RNA片段的RNA样品100μL装入PCR管内,降至-50℃,然后在10pa气压下冻干24h,形成干粉状后闭管制备而成;
阴性对照品冻干管通过以下方法制备得到:将无牦牛轮状病毒RNA片段的样品100μL装入PCR管内,降至-50℃,然后在10pa气压下冻干24h,形成干粉状后闭管制备而成。
9.根据权利要求3所述的基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒保存于4℃下。
10.一种基于恒温隔绝式荧光PCR平台的牦牛轮状病毒检测试剂盒的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)制备RNA模板:取粪便样本上清液200μL,参考金瑞泓捷(厦门)生物科技有限公司的PetNAD试剂盒提取说明书提取被检样本上清总RNA,制备得到RNA模板;
2)荧光PCR反应体系的制备:荧光PCR反应体系的制备于冰上操作;取100μL反应缓冲液加入到阳性对照品冻干管中混合,制备得到阳性对照品,然后取50μL反应缓冲液和5μL阳性对照品加入荧光定量PCR反应液冻干管中,制备得到阳性对照反应体系;取100μL反应缓冲液加入阴性对照品冻干管中,制备得到阴性对照品,然后取50μL反应缓冲液和5μL阴性对照品加入荧光定量PCR反应液冻干管中,制备得到阴性对照反应体系;取50μL反应缓冲液和5μL检测样本RNA加入荧光定量PCR反应液冻干管中,制备得到检测样本RNA反应体系;然后分别从各个反应体系中取50μL混合物移入恒温隔绝式荧光PCR反应管中;加样时注意避光操作;将制备好的荧光定量PCR反应管瞬时高速离心5s,避免出现气泡;
3)扩增检测:把PCR反应管放置于恒温隔绝式荧光PCR仪器内,按运行键,即开始反应;
4)检测结果判定:“+”表示阳性,“-”表示阴性。