本发明涉及生物医学试剂制备技术领域，具体地说是一种具有抗肿瘤活性的果聚糖羧酸酯及其合成方法。
背景技术：
多糖是生物体内一类重要的大分子，除了储存能量和支持结构外，还是一类重要的信息分子，在生物体内起着信息传递的功能。多糖一般具有非特异免疫性，能有效提高机体的免疫功能，增强抗病能力，具有防老、防衰、防癌、抗癌、抗肝炎等作用，受到人们的普遍重视，比如香菇多糖、云芝多糖、茯苓多糖等，能够治疗机体由于免疫系统受到损伤而引发的一些疾病，同时对机体无毒副作用，是一类有很大开发潜力的免疫调节剂。
人们经研究发现不仅多糖本身具有多种生物活性，同时发现它们的衍生物也具有独特的作用，多糖经化学修饰之后得到的衍生物较之多糖显示出活性的明显改善，有些甚至出现新的活性，如硫酸酯化多糖，具有抗肿瘤和抗病毒的活性。田庚元、李寿桐、徐愿坚在cn99113444中公开了果聚糖硫酸酯的合成方法及用途。乙酰化多糖中的乙酰基对多糖的生物活性很有影响，乙酰基能改变多糖分子的定向性和横向次序，从而改变了多糖的物理性质及生物活性。多糖支链上的羟基被乙酰基取代后，多糖的结构得到伸展，这使得更多的羟基能够暴露出来，致使多糖的溶解度增加，从而提高了活性(孟思彤,徐艳芝,王振月.多糖的化学修饰对其生物活性影响研究进展[j].天然产物研究与开发,2014,26:1901-1905.)。并且乙酰基的位置和数量对乙酰化多糖的抗肿瘤活性影响显著。(王晓璐,汲晨锋.多糖修饰物及其抗肿瘤作用机制研究[j].氨基酸和生物资源,2015,37(4):12-17.)
有研究发现，c-2酰化后的斜顶菌多糖抑瘤活性较修饰前有明显提高(梁忠岩,苗春艳,张翼伸.中国药学杂志,1996,31(10):615-617.)。有研究发现，部分酰化后的山药多糖(取代度为0.84)可同时显著地提高其对黑色素瘤和肺癌的抑制作用。低度乙酰化(取代度为0.32)使山药多糖的抗肿瘤作用显著地降低，而高度乙酰化(取代度为1.04)已使山药多糖基本丧失了抗肿瘤功能(赵国华,李志孝,陈宗道.中国食品学报,2004,4(1)：39-42.)。
还有研究表明，乙酰化的枸杞多糖可显著抑制h22肿瘤细胞增殖，提高免疫器官指数，提高血清il-2及tnf-α含量，也就是说经乙酰化的修饰后显著提高了枸杞多糖原有的抗氧化及抗肿瘤活性。(彭天元,刘家水,颜红专.乙酰化修饰枸杞多糖及其抗氧化、抗肿瘤活性研究[j].安徽中医药大学学报,2015,34(6):61-66.)
但是，到目前为止还未有对果聚糖的乙酰化或丙酰化反应的研究进行报道。鉴于牛膝多糖是一种免疫调节剂，具有抗肿瘤，抗凝血，抗衰老等作用，且经过硫酸酯、磷酸酯等结构衍生物的活性会有很大改善，从而对果聚糖酰化进行了一系列的研究，由此可以得到一种抗肿瘤的新分子及其合成方式。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种抗肿瘤的药物果聚糖羧酸酯及其合成方法，采用从中药怀牛膝中提取得到的果聚糖为原料，经乙酰化或丙酰化制得具有抗肿瘤活性的多糖衍生物为果聚糖羧酸酯，具有抗肿瘤和抗病毒的活性，其合成工艺简单，反应条件温和，操作方便，原料丰富，生产成本低，是一种很有应用前景的抗肿瘤分子，绿色环保、经济高效。
实现本发明目的的具体技术方案是：一种抗肿瘤的药物果聚糖羧酸酯，其特点是以中药怀牛膝中提取的果聚糖为原料，制取具有下述结构的果聚糖羧酸酯：
其中：r为ch3ch2co、ch3co或h；m，n＝0～19；m+n＝2～19。
一种抗肿瘤的药物果聚糖羧酸酯合成方法，其特点是以中药怀牛膝中提取且以结构式中r＝h的小分子果聚糖为原料，采用a、b或c方法进行合成反应，其反应产物在有机溶剂中溶解，并用纯水进行渗透膜透析后冷冻干燥，制得的多糖衍生物为果聚糖羧酸酯；所述有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷或乙醚。
所述a方法进行合成反应是小分子果聚糖与乙酸酐或丙酸酐和吡啶类催化剂按1:10～120:0.5～5摩尔比混合，然后在0～50℃温度下反应12～72h；所述吡啶类催化剂为4-二甲基氨基吡啶或4(1-吡咯烷)吡啶。
所述b方法进行合成反应是小分子果聚糖与乙酸乙烯酯或丙酸乙烯酯和无机碱溶液按1:10～100:1～100摩尔比混合，然后在0～50℃下反应0.5～5h；所述无机碱溶液为碳酸铵、碳酸钠、碳酸钾、磷酸钠、磷酸钾或磷酸铵溶液。
所述c方法进行合成反应是小分子果聚糖与乙酸酐或丙酸酐和固体酸催化剂中的硫酸按1:10～120:0.05～1摩尔比混合，然后在0～50℃温度下搅拌反应12～72h；所述固体酸催化剂为h2so4/sio2，其固载比为0.1ml～6mlh2so4:10gsio2。
所述果聚糖与乙酸酐或丙酸酐和h2so4/sio2固体酸催化剂之比优选1:15～25:0.1～0.5。
所述渗透膜采用截留分子量为500～1500的纳滤膜。
本发明与现有技术相比具有合成工艺简单，反应条件温和，操作方便，原料丰富，生产成本低，而产物具有抗肿瘤的活性，是一种很有应用前景的抗肿瘤分子，绿色环保、经济高效。
具体实施方式
本发明以三种合成方法分别制取具有抗肿瘤的药物果聚糖羧酸酯，将中药怀牛膝中提取得到的果聚糖(简称abps，又名牛膝多糖)为原料，也即是果聚糖羧酸酯结构式中r＝h的果聚糖为原料，与酰化试剂和催化剂在0～50℃下进行多糖衍生物的合成反应，反应产物在有机溶剂中溶解，用水进行膜透析后进行冷冻干燥即得。
其反应方程式如下：
其中：r为ch3ch2co、ch3co或h；m，n＝0～19；m+n＝2～19。
以下将通过具体的实施例对本发明做进一步的阐述：
实施例1
称取206.7mgabps与20mg4-二甲基氨基吡啶搅拌混合15分钟后加入10ml乙酸酐，反应液在10℃温度下进行72h多糖衍生物的合成反应，tlc监控反应完全。反应产物经二氯甲烷溶解后用纯水透析3天，然后冷冻干燥得到210.0mg乙酰化的牛膝多糖为果聚糖羧酸酯(cl-1)。
对所得产物果聚糖羧酸酯(cl-1)进行1h-nmr、gpc、ir表征，确认为目标产物，其测试数据如下：
1hnmr(500mhz；cdcl3)δ4.92-5.60(m,1.00h),3.53-4.54(m，3.64h),2.10(s,5.56h)；
gpc:mw:2475,mn:2253,相对分子质量分布宽度：1.10；
ir:3500cm-11748cm-1,1229cm-1。
实施例2
称取206.6mgabps与1.5ml丙酸乙烯酯混合后滴加12.5％的(nh4)2co3溶液，反应液在20℃温度下进行1h多糖衍生物的合成反应，tlc监控反应完全后，加入7ml乙酸乙酯，待反应产物溶解后用纯水透析3天，然后冷冻干燥得到191.7mg白色絮状粉末的丙酰化牛膝多糖为果聚糖羧酸酯(cl-2)。
对所得产物果聚糖羧酸酯(cl-2)进行1h-nmr、gpc、ir表征，确认为目标产物，其测试数据如下：
1hnmr(500mhz；cdcl3)δ4.90-5.50(m,0.66h),3.50-4.50(m，3.01h),2.10(m,3.01h)；
gpc:mw:2179,mn:1945,相对分子质量分布宽度：1.12；
ir:3500cm-1,1735cm-1,1240cm-1。
实施例3
称取206.6mgabps置于圆底烧瓶中，分别加入1.5ml的乙酸乙烯酯和10％的k2co3溶液，在35℃温度下进行6h多糖衍生物的合成反应，tlc监控反应完全后，加入17ml乙酸乙酯，待反应产物溶解后用纯水透析5天，然后冷冻干燥得到342.7mg白色絮状粉末的乙酰化牛膝多糖为果聚糖羧酸酯(cl-3)。
对所得产物果聚糖羧酸酯(cl-3)进行1h-nmr、gpc、ir表征，确认为目标产物，其测试数据如下：
1hnmr(500mhz；cdcl3)δ4.92-5.60(m,2.00h),3.53-4.54(m，9.36h),2.10(s,7.36h)；
gpc:mw:1987,mn:1713,相对分子质量分布宽度：1.16；
ir:3500cm-1,1740cm-1,1240cm-1。
实施例4
称取206.8mgabps与1.5ml乙酸乙烯酯和5％的na3po4溶液混合，在40℃温度下进行0.5h多糖衍生物的合成反应，反应完全后加入10ml乙醚，待反应产物溶解后用纯水透析2天，然后冷冻干燥得到338.4mg白色絮状粉末的乙酰化牛膝多糖为果聚糖羧酸酯(cl-4)。
对所得产物果聚糖羧酸酯(cl-4)进行1h-nmr、gpc、ir表征，确认为目标产物，其测试数据如下：
1hnmr(500mhz；cdcl3)δ5.00-5.60(m,0.81h),3.60-4.54(m，3.50h),2.10(s,3.78h)；
gpc:mw:2146,mn:1882,相对分子质量分布宽度：1.14；
ir:3500cm-1,1740cm-1,1240cm-1。
实施例5
称取206.9mgabps与1.5ml丙酸乙烯酯和7.5％的k2co3溶液混合，在50℃温度下进行0.5h多糖衍生物的合成反应，反应完全后加入15ml乙醚，待反应产物溶解后用纯水透析5天，然后冷冻干燥得到211.2mg白色絮状粉末的丙酰化牛膝多糖为果聚糖羧酸酯(cl-5)。
对所得产物果聚糖羧酸酯(cl-5)进行1h-nmr、gpc、ir表征，确认为目标产物，其测试数据如下：
1hnmr(500mhz；cdcl3)δ4.92-5.60(m,1.00h),3.53-4.54(m，4.64h),2.10(m,5.56h)；
gpc:mw:2342,mn:2053,相对分子质量分布宽度：1.14；
ir:3500cm-1,1735cm-1,1240cm-1。
实施例6
称取164mgabps与0.5ml(5mmol)乙酸酐混合，搅拌状态下加入5mg固体酸催化剂，在50℃温度下进行多糖衍生物的合成反应，搅拌15小时左右，反应完全后，过滤收集催化剂以再生循环，滤液加入15ml二氯甲烷，待反应产物溶解后用纯水透析5天，然后冷冻干燥得到241.2mg白色絮状粉末的乙酰化牛膝多糖为果聚糖羧酸酯(cl-6)；所述固体酸催化剂为h2so4/sio2，其固载比为3mlh2so4:10gsio2。
对所得产物果聚糖羧酸酯(cl-6)进行1h-nmr、gpc、ir表征，确认为目标产物，其测试数据如下：
1hnmr(500mhz；cdcl3)δ4.92-5.60(m,1.00h),3.53-4.54(m，4.64h),2.10(s,5.56h)；
gpc:mw:2377,mn:2085,相对分子质量分布宽度：1.14；ir:3500cm-1,1740cm-1,1240cm-1。
将上述各实施例制备的酰化牛膝多糖进行如下活性研究：
取(ovc)a2780细胞株，用0.4％台酚兰与细胞悬液1:1混匀，计数活细胞，然后用含10％小牛血清的培养液将细胞调整至3.125×105个/ml，备用。在无菌条件下，96孔细胞培养板中每孔加入已调整好的(ovc)a2780细胞悬液80μl和已设定好浓度的药物20μl。每个药物浓度设3复孔，然后放置于37℃、5％co2和饱和湿度的培养箱中培养48h时，加入0.25％mtt试液20μl于每孔，再继续培养4h，然后每孔再加入10％sds(100μl)，继续培养过夜。将培养细胞的96孔板在570nm波长下，用酶标仪测定od值，药物对肿瘤细胞生长的抑制率按下式(1)计算，
其计算结果汇总如下表1所示：
表1不同条件下得到的酰化牛膝多糖的活性研究
从表1中，可以看出多种酰化牛膝多糖样品都对人卵巢癌细胞系(ovc)a2780的生长均具有良好的抑制作用。
以上只是对本发明作进一步的说明，并非用以限制本专利，凡为本发明等效实施，均应包含于本专利的权利要求范围之内。