本发明属于植物分子标记制备
技术领域：
，具体涉及一种与甜瓜单性花性状相关acs-7基因的snp分子标记的制备与应用。
背景技术：
：甜瓜(cucumismelol.)属葫芦科(cucurbitaceae)黄瓜属(cucumis)，是国内外重要的园艺作物和经济作物，有两性花、雌花和雄花3种花。根据花的数量和组合将甜瓜植株分为以下几种：1)雄全同株，大部分单性雄花和少量的两性花；2)完全株，全部为两性花；3)雌雄异花同株，大部分的单性雄花和少量的雌花；4)雌全同株，大部分的单性雌花和少量的两性花；(5)三性混合株：同一植株上存在单性雄花、雌花和两性花；(6)全雌株，全部为单性雌花；(7)全雄株，全部为单性雄花。雌雄异花同株的甜瓜植株简称单性花甜瓜。单性花植物具有最高频的远系杂交能力，因而具有最大程度的选择优势。现有的甜瓜品种绝大多数为雄全同株，在常规的杂种一代种子生产中，进行人工去雄造成费时费工和杂交成本高，同时还会因去雄不完全，导致种子纯度降低，使优良杂交种的推广受到影响，因此甜瓜单性花与两性花相比是一种理想的杂交育种材料，在甜瓜育种中受到广泛关注。在甜瓜中，性别决定机制主要受雄全株(andromonoecious)(a/a)和全雌株(gynoecious)(g/g)这两对等位基因控制，二者间相互作用形成多样的性别类型。隐性等位基因a和g分别控制雌雄同株和雌雄同体植物中两性花的形成，同时也分别导致在雌雄同株中不存在雄性花。a_g_：雌雄同株，aag_：雄花两性花同株，aagg：全雌株，aagg：两性花株。boualem等(2008)开展了对控制a基因的编码一个乙烯合成酶——1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(acs)基因进行了克隆研究，将其命名为cmacs-7。将控制甜瓜雄全同株基因的研究推向新的研究领域，通过研究发现在cmacs-7基因的保守区段内发生了一个碱基的错义突变，该突变导致其编码蛋白的第57位氨基酸由丙氨酸转变为缬氨酸，体外酶活实验表明该位点的突变导致acs合成酶活性的丧失。用传统的回交育种方法对甜瓜单性花材料进行选育，不仅占地面积大，而且选育周期长，需要6-8个世代才能完成。利用分子标记辅助选择可以很好的解决上述问题，既可以大大减少占地面积，缩短育种年限，同时大大提高育种选择效率及准确性，因此充分利用甜瓜基因库资源，从中寻找甜瓜acs-7基因的多态性，并研究多态位点在不同群体中的分布特征，将为研究和利用acs-7基因作为潜在的单性花标记辅助选择奠定基础。技术实现要素：本发明的目的是提供一种与甜瓜单性花性状相关acs-7基因的单核苷酸多态性(snp)分子标记，提供与甜瓜单性花性状相关acs-7基因的snp分子标记的引物，以及利用该标记辅助育种的方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种与甜瓜单性花性状相关acs-7基因的snp分子标记，其核苷酸序列为seqidno.1，且其中第174位的碱基是c或t，导致甜瓜花型出现多态性。本发明还提供一种所述的snp分子标记在甜瓜单性花性状相关分子标记辅助育种选择中的应用。本发明还提供一种与甜瓜单性花性状相关acs-7基因的snp分子标记的引物对，其正向引物核苷酸序列如seqidno.2所述，即：5'-atcaatggcgattgagattgatattg-3'；其反向引物核苷酸序列如seqidno.3所述，即：5'-ctcattggcagcagtggcaccagcagt-3'。本发明还提供一种检测单性花甜瓜的试剂盒，包含权利要求3所述的引物对。进一步地，所述试剂盒还包含pcr缓冲液、dntp、mgcl2、taqdna聚合酶和ddh2o。本发明还提供一种所述的snp分子标记的制备方法，以甜瓜单性花和两性花材料的基因组dna为模板，以权利要求3所述的引物对，进行pcr扩增，将pcr扩增产物进行克隆、测序。上述方法中，pcr扩增反应条件如下：94℃变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后在72℃保温10min。本发明还提供一种所述的引物对检测单性花性状甜瓜的方法，其特征在于，提取待测甜瓜的基因组dna；以甜瓜基因组dna为模板，使用权利要求3的引物对进行pcr扩增；对扩增的pcr产物进行检测，若出现327bp和173bp的两条带，则待测甜瓜具有单性花性状。具体地，本发明所述snp分子标记在辅助育种中的应用如下：提取甜瓜基因组dna；根据http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/中公布的甜瓜acs-7基因序列信息，登录号为：eu791280，设计pcr扩增引物(其核苷酸序列如序列表seqidno：2和seqidno：3所示)。用该引物对甜瓜基因组dna进行pcr扩增，得到500bp的扩增片段，其核苷酸序列如序列表seqidno：1所示(其中：序列中的y显示碱基突变位置，即第174位)，该突变导致pcr-rflp-aluⅰ多态性，进而对所获得的pcr产物酶切分型，进行基因型与甜瓜花型性状之间的关联分析的应用，为甜瓜单性花性状相关的分子标记辅助选择提供一个新的分子标记。本发明公开了acs-7基因片段的多态性在甜瓜单性花检测中的应用，为甜瓜单性花性状标记辅助选择提供了新的分子标记。本发明利用分子标记辅助选择可以很好的解决回交育种占地面积大、选育周期长的上述问题，既可以大大减少占地面积，缩短育种年限，同时大大提高育种选择效率及准确性。本发明以单性花材料为母本，可减少杂交授粉时去雄工序，保证种子纯度。附图说明图1为本发明实施例1甜瓜acs-7基因snp多态位点酶切判型结果。图中：m泳道为dna分子量标记(dl2000，takara)；1-5为两性花甜瓜植株；6-10为单性花甜瓜植株。具体实施方式下面以甜瓜单性花性状相关的acs-7基因标记及其辅助育种技术的建立为例，对本发明的技术内容进行详细说明。以下实施例并不是对本发明的限制。甜瓜单性花性状相关的acs-7基因的snp分子标记及应用，包括：1.甜瓜单性花性状相关的acs-7基因片段的多态性分析；2.甜瓜单性花性状相关的acs-7基因标记的筛选；3.携带甜瓜单性花性状相关的acs-7基因标记个体的快速筛查。1.甜瓜单性花性状相关的acs-7基因片段的多态性分析参照分子克隆所述方法从甜瓜叶片中提取基因组dna；根据已知的acs-7基因序列中设计引物，克隆得到一段500bp的dna序列，连入pmd18-t载体，每个个体分别挑取2个克隆进行测序，将测序得到的核苷酸序列进行比对分析，发现了1处多态性位点。2.甜瓜单性花性状相关的acs-7基因标记的筛选对来自单性花和两性花群体的各4个个体的8个克隆进行测序，发现了1处多态性位点；随机选取50个单性花个体和50两性花个体，提取基因组dna，针对174c/t位点多态性，首先pcr扩增acs-7基因部分序列，然后选用限制性内切酶aluⅰ对pcr产物进行酶切，琼脂糖凝胶电泳后，发现2种基因型，174c/c和174t/t。174c/c个体在单性花群体中出现的频率显著高于两性花群体，而174t/t个体在两性花群体中出现的频率显著高于单性花群体。因此，将174c/c作为单性花性状相关的acs-7基因标记，而将174t/t作为两性花相关的acs-7基因标记。3.携带甜瓜单性花性状相关的acs-7基因标记个体的快速筛查取甜瓜单株真叶基因组dna1μl作为模板，以正向引物：5'-atcaatggcgattgagattgatattg-3'(seqidno：2)和反向引物：5'-ctcattggcagcagtggcaccagcagt-3'(seqidno：3)进行pcr扩增，利用pcr-rflp-aluⅰ对pcr产物进行分析，琼脂糖凝胶电泳分型后，选择含174c/c位点的个体作为单性花单株。实施例1甜瓜单性花性状相关的acs-7基因标记的获得1.甜瓜单性花性状相关的acs-7基因片段的多态性分析(1)甜瓜基因组dna的提取将单性花和两性花甜瓜种子播种于培养钵中，待甜瓜幼苗生长出两片真叶时，取4株单性花植株和4株两性花植株的真叶叶片放入液氮中进行保存。取1cm2大小的叶片放入1.5ml离心管，在液氮中研磨成粉末状，加入600μlctab缓冲液，65℃水浴抽提1h。加入等体积氯仿，混匀后在4℃条件下离心(12000rpm，10min)，取上清。重复上一步，将上清液转移到新的离心管中，加入等体积沉淀缓冲液(0.28mol/lnacl，70％乙醇)和200μl异丙醇，-20℃下静置1h。在4℃条件下离心(12000rpm，10min)，弃上清，用70％乙醇溶液洗涤沉淀，重复两次。低温风干后，用30μlddh2o溶解沉淀，基因组dna在-20℃下保存。(2)甜瓜acs-7基因片段扩增和序列分析利用设计合成的正向引物：5'-atcaatggcgattgagattgatattg-3'(seqidno：2)和反向引物：5'-ctcattggcagcagtggcaccagcagt-3'(seqidno：3)扩增acs-7基因片段。pcr反应体系为25μl，taqdnapolymerase0.2μl，10×pcr缓冲液2.5μl，mgcl2(25mm)2.5μl，2.5mmol/ldntps2.0μl，基因组dna1.0μl，上、下游引物各1.0μl，ddh2o14.8μl。pcr扩增程序：94℃变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后在72℃保温10min。pcr扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，用纯化试剂盒(tiangelmidipurificationkit，天根生物)回收目的片段，连接到pmd18-t载体(pmd18-tvectorcloningkit，takara)，并转化到top10大肠杆菌感受态细胞，在含氨苄青霉素的平板上挑取单菌落，进行菌落pcr筛选鉴定，阳性克隆由上海生工生物工程(上海)股份有限公司测序。经过测序发现，4株单性花植株与4株两性花植株pcr产物的dna序列内存在一个snp多态性，即174c/t突变。2.甜瓜单性花性状相关的acs-7基因标记的筛选将pcr扩增产物35μl，10×buffer4.0μl，aluⅰ1.0μl，样品混匀后离心，在37℃水浴锅中酶切过夜。取酶切产物20μl，加6×溴酚蓝上样缓冲液4μl，以90v电压在1.5％琼脂糖凝胶中电泳90min。在紫外灯下观察拍照，结果见图1(甜瓜acs-7基因snp多态位点酶切判型结果，m泳道为dna分子量标记(dl2000，takara)；1-5为两性花甜瓜植株；6-10为单性花甜瓜植株)。基因型分析：如图1所示，用上述引物对扩增甜瓜基因组dna获得的500bp的特异性扩增片段，序列分析在174bp处存在174c/t突变，并导致aluⅰ多态性。其中174c/c是形成酶切位点的等位基因，电泳检测时出现327bp和173bp的两条带；174t/t是没有形成酶切位点的等位基因，电泳检测时出现一条500bp的条带。提取50份单性花和50份两性花甜瓜的基因组dna，采用pcr-rflp-aluⅰ方法筛选携带甜瓜单性花相关基因标记个体。统计单性花群体和两性花群体中在174的位点不同基因型个体出现的频率(参见表1)，利用spss11.5软件进行chi-squaretest分析后发现，174c/c个体在单性花群体中出现的频率显著高于两性花群体，174t/t个体在单性花群体中出现的频率显著低于两性花群体(参见表1)。因此，174c/c为单性花性状相关的acs-7基因标记，而174t/t为两性花性状相关的acs-7基因标记。表1：甜瓜acs-7不同基因型在单性花群体和两性花群体中分布频率的卡方检验单核苷酸多态性单性花群体(％)两性花群体(％)chi-square(p)检验174t/t896p<0.01174c/c924p<0.013.携带甜瓜单性花性状相关的acs-7基因标记个体的快速筛查取甜瓜真叶dna1μl作为模版，以正向引物：5'-atcaatggcgattgagattgatattg-3'(seqidno：2)和反向引物：5'-ctcattggcagcagtggcaccagcagt-3'(seqidno：3)为扩增引物按以下程序进行pcr扩增：94℃变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后在72℃保温10min。取35μlpcr扩增产物用于酶切，酶切体系：10×buffer4.0μl，aluⅰ1.0μl，pcr产物35μl混匀后离心，在37℃水浴锅中酶切过夜。取酶切产物20μl，加6×溴酚蓝上样缓冲液4μl，以90v电压在1.5％琼脂糖凝胶中电泳90min。电泳结果参照图1，选择174c/c基因型的个体作为甜瓜单性花个体。实施例2甜瓜单性花性状相关的acs-7基因标记辅助育种方法以在单性花群体中高频出现的acs-7基因型174c/c作为单性花相关的acs-7基因标记。将携带这种单性花相关基因标记的甜瓜进行繁殖，培育后代，克隆获得后代中的acs-7基因，研究其多态性；研究acs-7基因标记的遗传规律及其与甜瓜单性花性状的关系，从中筛选出含有acs-7基因的标记，以单性花材料为母本，可减少杂交授粉时去雄工序，保证种子纯度。sequencelisting<110>青岛科技大学，青岛市农业科学研究院<120>甜瓜单性花性状相关acs-7基因的snp分子标记及应用<130><160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>500<212>dna<213>甜瓜（cucumismelol.）<220><221>gene<222>（1）..（500）<223><220><221>mutation<222>（174）..（174）<223><400>1atcaatggcgattgagattgatattgagcaaaatccaacggttgaactttcgcgaatcgg60aacatcagaaacacacggcgaagattcgccgtattttgctggctggaaagcgtatgatga120agatccttataatgaatcaacaaatccttctggtgttattcaaatgggcttagytgaaaa180tcaagtaagaatatataacttttttttgttttgttttgctttgtaaggagattgggtttt240tttttttaattgggtttgtgttggaatttatgaaacaggtgtcatttgacttattggagg300aatatttggaggaaaattgtgagggagaagggaattatttaaattctgggtttagagaaa360atgctttatttcaagactatcatggtcttttctcatttagaagtgcaatgggaagtttta420tggaagagattagaggtggaagagcaaaatttgacccaaatcgagttgttttaactgctg480gtgccactgctgccaatgag500<210>2<211>22<212>dna<213>人工合成<400>2atcaatggcgattgagattgatattg22<210>3<211>27<212>dna<213>人工合成<400>3ctcattggcagcagtggcaccagcagt27当前第1页12