一种端基含硫修饰的DNA及其制备方法与流程

本发明涉及dna端基修饰
技术领域：
，具体涉及一种端基含硫修饰的dna及其制备方法。
背景技术：
：端基含硫修饰的dna在生物分析、智能纳米材料制备以及分子生物学中均具有重要的意义。自上世纪九十年代dna固相合成技术成熟以来，人们开发出了多种用于制备端基含硫修饰的dna的方法，例如采用硫醇修饰的含硫端基修饰试剂与dna合成制备得到端基含硫修饰的dna，但是该方法在制备中，硫醇容易被氧化形成二硫醚结构，稳定性较差，而且硫醇中巯基与贵金属纳米粒子，如金、银或铂等纳米颗粒的结合性能相对较弱，从而使最终获取的端基含硫修饰的dna在智能纳米材料方面使用效果不佳。为了进一步改进端基含硫修饰的dna及其制备方法，现有技术中开发出含有更加稳定二硫键的dna修饰单元，来弥补硫醇类端基修饰试剂的缺陷。但目前可选择的含二硫键的dna端基化修饰试剂很少，无法满足日益增长的科研和商业需求。因此，提出一种优化改进的端基含硫修饰的dna及其制备方法成为本领域技术人员亟待解决的技术难题技术实现要素：本发明为了解决上述技术问题，提供一种端基含硫修饰的dna及其制备方法，通过简单的还原和酯化等标准的有机单元反应来制备2-氰乙基-n,n-二异丙基-亚磷酰胺硫辛醇酯，最终产物可直接用于dna合成仪上，极大简化了dna端基化的操作。为了达到上述技术效果，本发明包括以下技术方案：一种端基含硫修饰的dna，其结构式如i所示：一种端基含硫修饰的dna的制备方法，包括以下步骤：步骤一：制备亚磷酰胺硫辛醇酯：包括以硫辛酸为原料经还原反应得到硫辛醇后，经酯化反应得到亚磷酰胺硫辛醇酯的步骤；步骤二：制备端基修饰的dna：取亚磷酰胺硫辛醇酯溶于无水乙腈中作为端基修饰位试剂与dna合成得到端基含硫修饰的dna。作为优选：所述硫辛酸在无水四氢呋喃中以三甲氧基硼氢化钠和硼酸作为还原剂制得硫辛醇。作为优选：所述还原反应具体包括以下步骤：取三甲氧基硼氢化钠和硼酸溶于无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下加入硫辛酸，于15～25℃搅拌20～30h；所述三甲氧基硼氢化钠、硼酸和硫辛酸的质量比为依次为1～5：0.15～0.3：1，所述无水四氢呋喃溶液中硫辛酸的质量浓度为0.015～0.025g/ml。作为优选：所述还原反应结束后，向所述还原反应液中滴加硫酸溶液，过滤后取滤液加入氯仿和饱和食盐水洗涤，分出有机相经干燥处理后，蒸发有机相得到硫辛醇。作为优选：滴加的所述硫酸溶液浓度为1～4mol/l，滴加的所述硫酸溶液中的硫酸与反应液中硫辛酸的质量比3.50～4.50:1，所述氯仿与饱和食盐水的体积比为1～3：1。作为优选：所述酯化反应包括以硫辛醇为原料与2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺在无水三乙胺和无水四氢呋喃中制备得到亚磷酰胺硫辛醇酯的步骤。作为优选：所述酯化反应具体包括以下步骤：取硫辛醇和无水三乙胺溶于无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺，于室温下搅拌20～30h；所述硫辛醇、无水三乙胺和2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺的质量比为1.9:1.2:2.4；所述无水四氢呋喃中硫辛醇的质量浓度为0.035～0.040g/ml。作为优选：所述酯化反应结束后过滤，取滤液以饱和碳酸氢钠溶液洗涤后，取有机相经无水硫酸钠干燥得到亚磷酰胺硫辛醇酯。作为优选：所述步骤一具体步骤如下：取三甲氧基硼氢化钠和硼酸溶于无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下加入硫辛酸，于15～25℃搅拌20～30h，还原反应结束后，滴加浓度为1～4mol/l的硫酸溶液，过滤后取滤液加入氯仿和饱和食盐水洗涤，分出有机相经干燥处理，并蒸发有机相得到硫辛醇；所述三甲氧基硼氢化钠、硼酸和硫辛酸的质量比依次为1～5：0.15～0.3：1，所述无水四氢呋喃溶液中硫辛酸的质量浓度为0.015～0.025g/ml，滴加的所述硫酸溶液中的硫酸与反应液中硫辛酸的质量比3.50～4.50:1，所述氯仿与饱和食盐水的体积比为1～3：1；取硫辛醇和无水三乙胺溶于无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺，于室温下搅拌20～30h，反应结束后过滤，取滤液以饱和碳酸氢钠溶液洗涤后，取有机相经无水硫酸钠干燥得到亚磷酰胺硫辛醇酯；所述硫辛醇、无水三乙胺和2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺的质量比为1.9:1.2:2.4；所述无水四氢呋喃中硫辛醇的质量浓度为0.035～0.040g/ml；所述步骤二中取合成后的产物分散于氨水中，并密闭加热后，离心除去不溶物，取溶液经浓缩处理得到端基含硫修饰的dna。采用上述技术方案，包括以下有益效果：1、本发明获取的端基含硫修饰的dna可用于修饰贵金属纳米粒子如金纳米粒子、金纳米棒、银纳米粒子，铂纳米粒子以及金-银核壳结构纳米颗粒，荧光量子点，多种金属-非金属纳米粒子等领域中，在生物大分子修饰，生物分子识别和生物分子间作用力研究等领域均有重要应用。2、本发明提供的亚磷酰胺硫辛醇酯可作为亚膦酰亚胺试剂，直接用于dna合成仪上对dna的端基进行修饰，以制备得到端基含硫修饰的dna，表现出了良好的普适性和稳定性，为dna端基修饰提供了新的选择，极大简化了合成工作量，具有良好的商业化前景。3、本发明以硫辛酸为原料，经过还原和酯化得到一类含有亚膦酰亚胺酯的含硫试剂，其合成路线简明，操作便捷，中间体及产物的纯化方式简单，可以实现高效大量制备目标产物，为dna的5’端巯基/二硫键修饰提供了一种成本可控，简单高效制备方法。4、本发明通过核磁和质谱对合成过程中的中间体及最终产物进行了结构和纯度的表征，证明中间体的结构信息正确。并采用高效液相色谱和质谱确认了修饰有硫辛醇单元的dna结构信息，以进一步验证本发明方法的有效性。附图说明图1为本发明实施例中硫辛醇的核磁共振氢谱图；图2为本发明实施例中硫辛醇的esi-ms结构信息表征图；图3为本发明实施例中亚磷酰胺硫辛醇酯的核磁共振氢谱图；图4为本发明实施例中亚磷酰胺硫辛醇酯的esi-ms结构信息表征图；图5为本发明实施例中未做端基修饰的dna高效液相色谱图；图6为本发明实施例中端基含硫修饰的dna高效液相色谱图；图7为本发明实施例中未做端基修饰的dna和端基含硫修饰的dna在高效液相色谱上的保留时间图。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。一种端基含硫修饰的dna，其结构式如i所示：一种端基含硫修饰的dna的制备方法，包括以下步骤：步骤一：制备亚磷酰胺硫辛醇酯：包括以硫辛酸为原料经还原反应得到硫辛醇后，经酯化反应得到亚磷酰胺硫辛醇酯的步骤；步骤二：制备端基修饰的dna：取亚磷酰胺硫辛醇酯溶于无水乙腈中作为端基修饰位试剂与dna合成得到端基含硫修饰的dna。步骤一中的反应过程如反应式i所示：其中化合物iii为硫辛酸，化合物iv为硫辛醇，化合物ii为亚磷酰胺硫辛醇酯。步骤二中的反应过程如反应式ii所示：其中化合物v为固载于载体上的5'端羟基化dna序列，化合物vi为固载于载体上的5'端官能化dna序列，所述化合物i为端基含硫修饰的dna。在一可选实施例中：所述dna的序列可以为seqidno:1所示，但并不局限于该序列。在一可选实施例中：所述硫辛酸在无水四氢呋喃中以三甲氧基硼氢化钠和硼酸作为还原剂制得硫辛醇。在一可选实施例中：所述还原反应具体包括以下步骤：取三甲氧基硼氢化钠和硼酸溶于无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下加入硫辛酸，于15～25℃搅拌20～30h；所述三甲氧基硼氢化钠、硼酸和硫辛酸的质量比为依次为1～5：0.15～0.3：1，所述无水四氢呋喃溶液中硫辛酸的质量浓度为0.015～0.025g/ml。在一可选实施例中：所述还原反应结束后，向所述还原反应液中滴加硫酸溶液，过滤后取滤液加入氯仿和饱和食盐水洗涤，分出有机相经干燥处理后，蒸发有机相得到硫辛醇。在一可选实施例中：滴加的所述硫酸溶液浓度为1～4mol/l，滴加的所述硫酸溶液中的硫酸与反应液中硫辛酸的质量比3.50～4.50:1，所述氯仿与饱和食盐水的体积比为1～3：1。在一可选实施例中：所述酯化反应包括以硫辛醇为原料与2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺在无水三乙胺和无水四氢呋喃中制备得到亚磷酰胺硫辛醇酯的步骤。在一可选实施例中：所述酯化反应具体包括以下步骤：取硫辛醇和无水三乙胺溶于无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺，于室温下搅拌20～30h；所述硫辛醇、无水三乙胺和2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺的质量比为1.9:1.2:2.4；所述无水四氢呋喃中硫辛醇的质量浓度为0.035～0.040g/ml。在一可选实施例中：所述酯化反应结束后过滤，取滤液以饱和碳酸氢钠溶液洗涤后，取有机相经无水硫酸钠干燥得到亚磷酰胺硫辛醇酯。在一可选实施例中：所述步骤一具体步骤如下：取三甲氧基硼氢化钠和硼酸溶于无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下加入硫辛酸，于15～25℃搅拌20～30h，还原反应结束后，滴加浓度为1～4mol/l的硫酸溶液，过滤后取滤液加入氯仿和饱和食盐水洗涤，分出有机相经干燥处理，并蒸发有机相得到硫辛醇；所述三甲氧基硼氢化钠、硼酸和硫辛酸的质量比依次为1～5：0.15～0.3：1，所述无水四氢呋喃溶液中硫辛酸的质量浓度为0.015～0.025g/ml，滴加的所述硫酸溶液中的硫酸与反应液中硫辛酸的质量比3.50～4.50:1，所述氯仿与饱和食盐水的体积比为1～3：1；取硫辛醇和无水三乙胺溶于无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺，于室温下搅拌20～30h，反应结束后过滤，取滤液以饱和碳酸氢钠溶液洗涤后，取有机相经无水硫酸钠干燥得到亚磷酰胺硫辛醇酯；所述硫辛醇、无水三乙胺和2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺的质量比为1.9:1.2:2.4；所述无水四氢呋喃中硫辛醇的质量浓度为0.035～0.040g/ml；所述步骤二中取合成后的产物分散于氨水中，并密闭加热后，离心除去不溶物，取溶液经浓缩处理得到端基含硫修饰的dna。实施例1：一种端基含硫修饰的dna的制备方法，包括以下步骤：步骤一：制备硫辛醇：取1.0g三甲氧基硼氢化钠和0.15g硼酸溶于66毫升无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下一次性加入1.0g硫辛酸于66毫升无水四氢呋喃中的溶液，反应液在15℃搅拌30小时。反应结束后，向反应液中滴加9毫升3m硫酸溶液，滤除不溶物，滤液加入100毫升氯仿和100毫升饱和食盐水洗涤，分出有机相，无水硫酸钠干燥。旋转蒸发有机相，得到1.5g硫辛醇(淡黄色粘稠液体)，收率81％。中间产物硫辛醇即上述化学式中化合物iv的核磁共振氢谱检测结果如图1所示：1h-nmr(cdcl3,400mhz):δ＝1.26-1.70(m,ch2,8h),1.91-1.93(m,ch,1h),2.46-2.48(m,ch,1h),3.14-3.18(m,ch2,2h),3.56-3.59(m,ch,1h)，3.64-3.67(m,ch2o,2h).中间产物硫辛醇即上述化学式中化合物iv的esi-ms进行结构信息表征图如图2所示：esi-ms:c8h16os2,calc192.0643,found175.0629(m-oh),193.0733(m+h+),215.0557(m+na+)。步骤二：制备亚磷酰胺硫辛醇酯：取1.9g硫辛醇和1.2g无水三乙胺溶于55毫升无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加2.4g2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺。反应于室温下搅拌20小时，滤除不溶物，滤液以饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机相无水硫酸钠干燥。得到2.5g2-氰乙基-n,n-二异丙基-亚磷酰胺硫辛醇酯(黄色粘稠液体)，收率68％。中间产物亚磷酰胺硫辛醇酯即上述化学式中化合物i的核磁共振氢谱检测结果如图3所示：1h-nmr(d6-dmso,400mhz):δ＝1.15-1.20(d,ch3,12h),1.21-1.49(m,ch2,4h),1.49-1.68(m,ch2,4h),1.72-1.90(m,ch,1h),2.14-2.28(m,ch,1h),2.54-2.69(m,sch,2h),2.70-2.99(m,sch2+ncch2,4h),3.19-3.41(m,nch,2h)，3.77-3.95(m,ch2o,4h).中间产物亚磷酰胺硫辛醇酯即上述化学式中化合物i的esi-ms进行结构信息表征图如图4所示：esi-ms:c17h32n2o2ps2,calc392.1721,found392.1718(m+),393.1796(m+h+)。步骤三：取540mg的2-氰乙基-n,n-二异丙基-硫辛醇亚磷酰胺酯溶于10毫升无水乙腈中，氮气保护下转移至abi394dna合成仪的端基修饰位试剂瓶中。输入dna序列如seqidno：1所示，执行1μmol量级的合成。步骤四：合成完毕后将固相载体取出，分散在1毫升23％氨水中，55℃下密闭加热2小时，离心去除不溶物，溶液浓缩即得到目标产物。实施例2：一种端基含硫修饰的dna的制备方法，包括以下步骤：步骤一：制备硫辛醇：取3.0g三甲氧基硼氢化钠和0.2g硼酸溶于200毫升无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下一次性加入2.0g硫辛酸于200毫升无水四氢呋喃中的溶液，反应液在20℃搅拌24小时。反应结束后，向反应液中滴加20毫升4m硫酸溶液，滤除不溶物，滤液加入200毫升氯仿和100毫升饱和食盐水洗涤，分出有机相，无水硫酸钠干燥。旋转蒸发有机相，得到1.6g硫辛醇(淡黄色粘稠液体)，收率83％。中间产物硫辛醇即上述化学式中化合物iv的核磁共振氢谱检测结果如图1所示：1h-nmr(cdcl3,400mhz):δ＝1.26-1.70(m,ch2,8h),1.91-1.93(m,ch,1h),2.46-2.48(m,ch,1h),3.14-3.18(m,ch2,2h),3.56-3.59(m,ch,1h)，3.64-3.67(m,ch2o,2h).中间产物硫辛醇即上述化学式中化合物iv的esi-ms进行结构信息表征图如图2所示：esi-ms:c8h16os2,calc192.0643,found175.0629(m-oh),193.0733(m+h+),215.0557(m+na+)。步骤二：制备亚磷酰胺硫辛醇酯：取1.9g硫辛醇和1.2g无水三乙胺溶于50毫升无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加2.4g2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺。反应于室温下搅拌24小时，滤除不溶物，滤液以饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机相无水硫酸钠干燥。得到2.7g2-氰乙基-n,n-二异丙基-亚磷酰胺硫辛醇酯(黄色粘稠液体)，收率70％。中间产物亚磷酰胺硫辛醇酯即上述化学式中化合物i的核磁共振氢谱检测结果如图3所示：1h-nmr(d6-dmso,400mhz):δ＝1.15-1.20(d,ch3,12h),1.21-1.49(m,ch2,4h),1.49-1.68(m,ch2,4h),1.72-1.90(m,ch,1h),2.14-2.28(m,ch,1h),2.54-2.69(m,sch,2h),2.70-2.99(m,sch2+ncch2,4h),3.19-3.41(m,nch,2h)，3.77-3.95(m,ch2o,4h).中间产物亚磷酰胺硫辛醇酯即上述化学式中化合物i的esi-ms进行结构信息表征图如图4所示：esi-ms:c17h32n2o2ps2,calc392.1721,found392.1718(m+),393.1796(m+h+)。步骤三：取540mg的2-氰乙基-n,n-二异丙基-硫辛醇亚磷酰胺酯溶于10毫升无水乙腈中，氮气保护下转移至abi394dna合成仪的端基修饰位试剂瓶中。输入dna序列如seqidno：1所示，执行1μmol量级的合成。步骤四：合成完毕后将固相载体取出，分散在1毫升23％氨水中，55℃下密闭加热2小时，离心去除不溶物，溶液浓缩即得到目标产物。实施例3：一种端基含硫修饰的dna的制备方法，包括以下步骤：步骤一：制备硫辛醇：取5.0g三甲氧基硼氢化钠和0.3g硼酸溶于200毫升无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下一次性加入1.0g硫辛酸于200毫升无水四氢呋喃中的溶液，反应液在25℃搅拌20小时。反应结束后，向反应液中滴加57毫升1m硫酸溶液，滤除不溶物，滤液加入300毫升氯仿和100毫升饱和食盐水洗涤，分出有机相，无水硫酸钠干燥。旋转蒸发有机相，得到1.5g硫辛醇(淡黄色粘稠液体)，收率81％。中间产物硫辛醇即上述化学式中化合物iv的核磁共振氢谱检测结果如图1所示：1h-nmr(cdcl3,400mhz):δ＝1.26-1.70(m,ch2,8h),1.91-1.93(m,ch,1h),2.46-2.48(m,ch,1h),3.14-3.18(m,ch2,2h),3.56-3.59(m,ch,1h)，3.64-3.67(m,ch2o,2h).中间产物硫辛醇即上述化学式中化合物iv的esi-ms进行结构信息表征图如图2所示：esi-ms:c8h16os2,calc192.0643,found175.0629(m-oh),193.0733(m+h+),215.0557(m+na+)。步骤二：制备亚磷酰胺硫辛醇酯：1.9g硫辛醇和1.2g无水三乙胺溶于48毫升无水四氢呋喃中，冰浴搅拌下滴加2.4g2-氰乙基-n,n-二异丙基氯代亚磷酰胺。反应于室温下搅拌30小时，滤除不溶物，滤液以饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机相无水硫酸钠干燥。得到2.7g2-氰乙基-n,n-二异丙基-亚磷酰胺硫辛醇酯(黄色粘稠液体)，收率69％。中间产物亚磷酰胺硫辛醇酯即上述化学式中化合物i的核磁共振氢谱检测结果如图3所示：1h-nmr(d6-dmso,400mhz):δ＝1.15-1.20(d,ch3,12h),1.21-1.49(m,ch2,4h),1.49-1.68(m,ch2,4h),1.72-1.90(m,ch,1h),2.14-2.28(m,ch,1h),2.54-2.69(m,sch,2h),2.70-2.99(m,sch2+ncch2,4h),3.19-3.41(m,nch,2h)，3.77-3.95(m,ch2o,4h).中间产物亚磷酰胺硫辛醇酯即上述化学式中化合物i的esi-ms进行结构信息表征图如图4所示：esi-ms:c17h32n2o2ps2,calc392.1721,found392.1718(m+),393.1796(m+h+)。步骤三：取540mg的2-氰乙基-n,n-二异丙基-硫辛醇亚磷酰胺酯溶于10毫升无水乙腈中，氮气保护下转移至abi394dna合成仪的端基修饰位试剂瓶中。输入dna序列如seqidno：1所示，执行1μmol量级的合成。步骤四：合成完毕后将固相载体取出，分散在1毫升23％氨水中，55℃下密闭加热2小时，离心去除不溶物，溶液浓缩即得到目标产物。基于高效液相色谱检测实施例1～3所示未做端基修饰的dna与端基含硫修饰的dna的分子量，结果如图5和图6所示，如图7所示为dna和端基含硫修饰的dna在高效液相色谱上的保留时间，计算结果如表1所示：表1端基含硫修饰的dna的分子量样品计算分子量(g/mole)实测分子量(g/mole)dna60516050modified-dna63056305上述结构表征中实验仪器：核磁型号为brukeramx400spectrometer(500mhz)，质谱型号为agilent6510q-tof，高效液相色谱型号为waters2695，检测柱型号为xbriageoligonucleotidesbehc18(2.1mm×50mm；column2.5um)，液相色谱中淋洗条件如表2和表3所示：表2淋洗条件样品保留时间(min)dna30.16modified-dna22.08表3淋洗条件以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>中国石油大学（华东）<120>一种端基含硫修饰的dna及其制备方法<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cctagattcagttcaactta20当前第1页12