PDL‑1基因靶向特异性甲基化表观遗传修饰抗肿瘤分子及其用途的制作方法

本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及pdl-1基因靶向特异性甲基化表观遗传修饰抗肿瘤分子及其用途。

背景技术：

免疫（immunity）通常是指生物体对感染疾病的抵抗、对自身与非自身物质的识别以及对体内产生的变性物质的监视与清除。免疫分为先天性免疫（innateimmunity）和获得性免疫（acquiredimmunity），其中又可细分为细胞免疫和体液免疫。免疫调控是免疫的重要环节。免疫调控（immunoregulation）是指生物体对免疫应答过程和免疫应答水平的一种执行及合理调控，以适应免疫防御的需要、维持生物体的体内稳定（homeostasis）。其本质是在遗传基因的调控下、多因素参与的调控过程。

淋巴细胞活化是细胞介导的免疫应答当中的重要过程。抗原经apc捕获、加工、处理和呈递后，将信息传递给t细胞，促使t细胞增殖分化为cd4+的th细胞，th细胞能够分泌il-2、il-4、il-12和ifn-γ等细胞因子，进一步促进cd8+的细胞毒性t细胞tc细胞的增殖、分化、成熟。tc细胞能够特异性的识别特定的抗原决定簇，通过与mhc-ⅰ类分子介导的或非特异性粘附分子作用的、含有特异性抗原肽的靶细胞接触，定向释放细胞毒素（蛋白水解酶、丝氨酸脂酶等），对靶细胞进行细胞毒性作用；或通过释放tnf-α、tnf-β，直接对靶细胞进行毒性作用。

t细胞活化需几个因素同时作用：（1）apc表面mhc-抗原肽复合物与t细胞表面的tcr结合；（2）apc表面b7分子与t细胞表面cd28分子结合；（3）il-1、il-2等细胞因子刺激t细胞活化。

免疫检测点（immunecheckpoint）是在生物体免疫系统中存在的，对于免疫体系发挥功能起到限制作用的一些通路上的重要分子，它们对免疫系统的免疫识别、免疫耐受的形成以及免疫强度的调节具有关键的作用。目前已经发现的免疫检测点有很多，它们多表达于免疫细胞表面，起到限制免疫细胞功能的作用。它们胞内段一般含多个免疫受体酪氨酸抑制基序（immuno-receptortyrosine-basedinhibitorymotif，itim），通过itim基序发挥负调控的作用。现在比较明确的免疫检测点包括：ctla-4，pd-1，pd-l1等。

pd-1（cd279）/pd-l1（cd274）信号通路是介导t细胞免疫负调控及肿瘤凋亡的重要信号，是肿瘤细胞实现免疫逃避的主要信号通路之一。pd-1表达于活化的t细胞表面，pd-l1表达于多种肿瘤细胞的表面。最近的研究表明，通过阻断pd-1和pd-l1的信号通路，可有效的提高t细胞的反应及其抗肿瘤作用。pd-1是由日本京都大学的tasukuhonjo于1992年在凋亡的t细胞杂交瘤细胞上，通过削减杂交的方法率先发现的，由于其功能和细胞的程序性凋亡有关，所以被命名为细胞程序性死亡受体174。和其他免疫负调控受体一样，pd-1表达于活化的t细胞、treg、b细胞、单个核细胞、dc细胞、nk细胞以及nkt细胞表面。人的pd-1蛋白的基因定位于2q37.3染色体上，全长9028bp，基因序列与ctla-4有23%的相似性，包含有5个外显子。pd-1分子大小为55kda，属于免疫球蛋白家族中的ⅰ型跨膜蛋白。胞外段含有一个igv结构结构域，有4个n连接位点被糖基化；胞内段含有一个itim和一个itsm，当接收到信号时，该区域会抑制细胞质的磷酸化，发挥拮抗免疫作用的功能。

pd-l1是pd-1的配体，它参与t细胞活化中的负调控作用。人pd-l1基因定位于9q24染色体上，全长20065bp，有6个外显子，编码290个氨基酸。pd-l1是ⅰ型跨膜蛋白，由igv、igc的胞外结构域、疏水跨膜结构域和30个氨基酸组成的带电胞内区域组成。人pd-l1的mrna广泛出现在人体的各个组织中，但并不表达于细胞膜上。目前仅发现它在小部分细胞（如肝脏或肺中的巨噬样细胞）及部分免疫豁免组织（如眼睛、子宫等）细胞表面有表达。然而，pd-l1选择性高表达于肺癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、宫颈癌、肾癌、膀胱癌、肝癌、胶质细胞瘤、黑色素瘤及其他多种人类肿瘤细胞以及肿瘤微环境中浸润的淋巴细胞及内皮细胞表面，是一个特异性的高效、低毒的抗肿瘤靶点。

pd-l1可以被大量的细胞因子刺激而提高表达，如ifn-γ、tnfα、vege、gm-csf和if-10。在许多肿瘤细胞的表面都发现有pd-l1分子的表达，而在肿瘤浸润淋巴细胞当中（tumor-infiltratinglymphocytes，tils），pd-1会特异性的高表达，从而和pd-l1结合，抑制其作用。当肿瘤细胞被免疫系统攻击时，肿瘤细胞会开始过表达pd-l1分子，降低t细胞的作用，因而成功的逃避免疫的攻击。

在肿瘤的微环境中，t细胞可以被pd-1/pd-l1通路通过多种形式下调其免疫杀伤作用。现在已经被证实，pd-l1在肿瘤细胞表面的过表达，使得巨噬细胞、dcs、mdscs等的抗肿瘤作用被显著限制。磷酸化的akt、mtor、s6和erk2等分子是treg生长、分化过程中的重要分子，pd-l1可通过调节这些分子的分泌，促进treg细胞的分化，进而限制t细胞的功能。另一方面pd-1通过抑制pi3k通路的活性，下调抗凋亡蛋白bcl-xl的分泌，进而诱导活化的t细胞的凋亡。pd-1蛋白还可抑制tcr的活性，从而降低淋巴细胞生长相关的因子il-2的分泌，使细胞分裂停止。

在肿瘤免疫治疗中，通过打破免疫耐受，来实现特异性t细胞对肿瘤的杀伤，达到治疗肿瘤的目的。研究表明，pd-1/pd-l1在淋巴细胞及肿瘤细胞表面的表达，可降低免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，下调肿瘤免疫的应答。应用单抗封闭掉pd-1/pd-l1通路，治疗小鼠肿瘤模型，明显抑制了局部肿瘤的生长，表现出来良好的缓解症状。同时阻断该通路，可上调ifnγ分泌，达到抗肿瘤的目的。

本发明依据全新的表观遗传基因工程技术和免疫学原理，设计了针对人pd-l1基因启动子cpgii的核心序列特异性结合蛋白，并与甲基化酶（dnmts）的催化域融合，以构建靶向pd-l1基因的甲基化分子ppla，采用腺病毒进行包装，因此通过对pd-l1基因启动子的靶向甲基化，期望抑制癌细胞pd-l1基因的表达，以打破免疫耐受，达到对慢性病毒感染和肿瘤的治疗作用。而基因治疗的核心问题是选用安全有效的载体并将治疗基因导入靶细胞。腺病毒(adenovirus,ad)载体具有宿主范围广、效率高、稳定、安全、易操作等优点而备受重视。

技术实现要素：

本发明目的的目的在于提供一种pdl-1基因靶向特异性甲基化表观遗传修饰抗肿瘤分子及其用途。

本发明首先设计针对人pd-l1基因启动子，利用维持甲基化酶dnmt1的活性域与从头甲基化酶dnmt3a的活性域融合连接，并进行表观甲基化修饰的全新蛋白分子，以该蛋白分子来抑制pd-l1基因的表达，并最终制备用于抗肿瘤和抗病毒治疗药物。

本发明的一方面，提供一种识别人pd-l1基因启动子的特异性结合蛋白分子，其氨基酸序列为seq.id.no.1所示，命名为ppla。本发明利用生物信息学手段，首先通过真核生物基因启动子数据库分析pd-l1基因的启动子序列，以cpg岛软件分析启动子核心序列潜在的甲基化位点，再采用相应软件，设计具有针对dna序列特异性识别和结合功能的蛋白结构域，即得到所述的识别pd-l1基因启动子的特异性结合蛋白分子，其氨基酸序列为seq.id.no.1。

本发明的另一方面，提供编码上述蛋白分子ppla的基因，其核苷酸序列为seq.id.no.2所示。

本发明的再一方面，提供上述蛋白分子ppla的基因表达载体，包括选择人甲基化酶，重组至质粒pcdna3.1上，并在ｎ端串联表达ppla的基因表达质粒，进行腺病毒包装，构建pdl-1p靶向特异性dna甲基化酶结构域，见附图1所示。

本发明的再一方面，通过腺病毒载体导入人的细胞内，可高效表达出针对人pd-l1基因启动子序列特异的蛋白分子，并可对pdl-1基因产生甲基化表观遗传修饰的功能，实验证实，ppla具有高效抑制pdl-1基因表达的功能，即可有效的使pd-l1基因启动子甲基化，并能显著降低pd-l1基因的表达，从而达到抗肿瘤和抗病毒淋巴细胞、提高免疫功能的目的，实现抗肿瘤和抗病毒的治疗效果，这为肿瘤和病毒的防治提供了新的实验依据和技术手段。因此，提供上述蛋白分子ppla，或编码该蛋白分子ppla的基因，或其表达载体，可用于制备抗肿瘤和抗病毒的药物。

附图说明

图1是ppla腺病毒表达质粒结构图谱。

图2是ppla基因表达载体的腺病毒包装后细胞中表达图谱。

图3是ppla蛋白表达免疫印迹（westernblot）分析图谱。

图4是ppla蛋白与pd-l1基因启动子dna结合构象图。

图5是ppla对pd-l1基因的甲基化率影响。

图6是pd-l1分子编码mrna表达图谱。

图7是ppla转染细胞的facs分析其pd-l1表达量图谱。

图8是ppla抑制肿瘤细胞其pd-l1表达量图谱。

具体实施方式

1．人pd-l1基因启动子特异性结合蛋白的设计和合成

采用zftoolsver3.0软件，根据人pd-l1启动子区cpg位点，选择最佳序列，设计特异性结合蛋白。所选用的针对人pd-l1启动子区的dna结合并介导dna甲基化蛋白ppla的氨基酸序列为seq.id.no.1所示，相应的dna各结构域核苷酸序列为seq.id.no.2所示。

2.人pd-l1基因启动子靶向甲基化酶的构建及腺病毒包装

将人工合成的编码ppla的dna片段克隆重组至pcdna3.1（如图1）上，并对表达质粒进行腺病毒包装（如图2），获得表达的基因工程蛋白ppla，通过western-blot证实其蛋白量在130kda（如图3），通过生物信息学分析，模拟空间结构，其胞内表达的蛋白可以与pd-l1基因启动子结合（如图4）。我们通过甲基化测序，证实该蛋白可诱导pd-l1基因启动子发生特异性甲基化现象，同时分别在24h，48h，72h采用定量pcr，流逝细胞仪，westerblot进一步分析证实其可以导致pd-l1基因表达显著发生下降（如图6、7、8）。

序列表

<110>复旦大学

<120>pdl-1基因靶向特异性甲基化表观遗传修饰抗肿瘤分子及其用途

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