确定miR-27a基因的核心启动子及其内转录因子Myod结合位点的方法与流程

本发明涉及分子遗传学领域，尤其涉及确定mir-27a基因的核心启动子及mir-27a基因的核心启动子内转录因子myod结合位点的方法。

背景技术：

我国是畜牧业大国，畜牧业在国民经济中占有重要地位。繁殖和生长是决定规模化养殖产出的两大主要经济性状，在畜牧业中，母畜繁殖效益在总效益中占据更大的比例。繁殖性状具有遗传力低、选择周期长、选育进展慢等缺陷，成为制约畜牧业经济效益的主要原因。排卵率是产仔数性状的重要组分性状，卵巢中卵泡的生长发育决定了排卵数。因此探索卵巢中卵巢细胞基因表达情况、发育规律和调控因素，对于揭示排卵率的遗传调控机制，进行高繁殖力品种的选育具有重要意义。

microrna(mirna)是一类内源性的具有调控功能的非编码rna，长度一般为16-29核苷酸(nucleotide,nt)，与靶基因mrna的3’-utr结合来调控靶基因转录后表达。mirna作为一种小分子序列，可以全局调控基因的表达，功能涉及到组织生长、细胞凋亡、脂肪代谢、卵细胞发育、精子发生等重要生命过程。对于卵泡发育而言，mir-27a属于微核糖核酸(microrna)，是一类发挥重要调控作用的小分子调控物。

mir-27a通过与靶基因的3’-utr区序列特异性识别来实现对基因表达的调控作用，其前体也会受到特定转录因子的调控作用。mir-27a启动子(一段能与rna聚合酶(rnapolymerase)特异性识别并结合的dna序列，通常位于基因的5’非翻译区，长度约为200bp左右)通过启动子区的顺式作用元件(cis-actingelement)和反式作用因子(trans-actingfactor)的相互作用来实现调控作用。启动子发挥着类似“开关”的作用，在指挥基因活动的过程中发挥最关键的作用。启动子本质是一段dna序列，其本身不具备调控基因的功能，而是通过与特定的转录因子相互作用，特异的调节基因表达。启动子功能研究使我们更深入的了解生物生长发育的调控机制，对于研究功能基因的表达调控具有重要意义。

pgl3-basic是一类常用的报告基因，因其无启动子和增强子，可通过荧光素酶报告基因的表达来检测插入片段的启动活性，并且比较启动子的强弱，进而初步确定核心启动子区域。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种确定mir-27a基因的核心启动子及mir-27a基因的核心启动子内转录因子myod结合位点的方法，鉴定了mir-27a的核心区段，为基因工程和分子育种提供了新的启动子资源，详尽的验证了mir-27a启动子的各缺失区段在细胞中启动子活性和核心启动子区域内转录因子的调控作用，为mirna的表达调控带来了更深层次的认知，运用于家畜高繁殖力分子调控机制的研究，具有较好的应用前景。

本发明是这样实现的：

本发明提供一种确定mir-27a基因的核心启动子的方法，包括以下步骤：

步骤11、根据ncbi数据库中小鼠mir-27a的5’-utr的2000bp序列(核苷酸序列如seqidno：1所示)设计8条上游缺失片段引物(pf1-pf8)和1条共用下游引物(pr)；

步骤12、以小鼠血液全基因组dna为模板，利用聚合酶链式反应进行缺失片段的扩增，获得8段长度依次截短的mir-27a的5’-utr序列，核苷酸序列如seqidno：11—seqidno：18所示；对上述8段序列和pgl3-basic载体质粒依次经限制性内切酶酶切、琼脂糖凝胶电泳和切胶纯化处理；将处理好的8段序列和pgl3-basic载体质粒利用t4连接酶进行连接，然后转入大肠杆菌dh5α内，平板培养获取单菌落；最后提取菌液内质粒，通过测序确定载体构建完成；

步骤13：将cho细胞进行培养，接种到细胞培养板中，待密度达到80％后进行转染操作，内参选择海肾荧光素酶prl-tk，对cho细胞进行转染；

步骤14：转染24h后，利用细胞裂解液获得总蛋白，取含少量所述总蛋白的裂解液加入双荧光素酶报告基因检测试剂盒中配制的工作液，通过双荧光素酶报告基因对获得的总蛋白进行双荧光素酶活性检测。

本发明提供还提供一种确定mir-27a基因的核心启动子内转录因子myod结合位点的方法，包括以下步骤：

步骤21、根据所述方法得到mir-27a基因的核心启动子，利用转录因子预测软件预测核心启动子内的2个子myod结合位点(核苷酸序列如seqidno：19和seqidno：20所示)；

步骤22、将准备好的myod的过表达载体pc-myod和所述方法中得到的mir-27a的核心启动子双荧光素酶报告载体pgl3-d7瞬时共转染于cho细胞，待24h后进行双荧光素酶活性检测，得到试验组和对照组荧光检测值；

步骤23、利用定点突变技术改变2个myod结合位点共有部分的核苷酸序列，序列如序列表seqidno：21所示，构建突变型荧光表达载体pgl3-d7-mut，准备好的myod的过表达载体pc-myod与所述突变型荧光表达载体pgl3-d7-mut瞬时转染cho细胞，待24h后进行双荧光素酶活性检测，得到实验组检测值，将实验组检测值与所述对照组检测值进行比对，确定转录因子myod在mir-27a核心启动子上的结合位点。

本发明具有以下有益效果：

1、鉴定了mir-27a的核心区段，为基因工程和分子育种提供了新的启动子资源，具有灵敏度高、速度快和费用低等优点。

2、详尽的验证了mir-27a启动子的各缺失区段在细胞中启动子活性和核心启动子区域内转录因子的调控作用，为mirna的表达调控带来了更深层次的认知，运用于家畜高繁殖力分子调控机制的研究，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例提供的确定mir-27a基因的核心启动子的方法的流程图；

图2为本发明实施例提供的确定mir-27a基因的核心启动子内转录因子myod结合位点的方法的流程图；

图3是空载体pgl3-basic的结构图谱；

图4是内参prl-tk载体的结构图谱；

图5是本发明构建mir-27a缺失片段双荧光素酶表达载体pgl3的结构图谱；

图6是pgl3-d1、pgl3-d2、pgl3-d3、pgl3-d4、pgl3-d5、pgl3-d6、pgl3-d7、pgl3-d8和pgl3-basic分别转染cho细胞24h后相对荧光素酶活性检测结果。图中：纵坐标relatedluciferaseactivity表示相对荧光素酶活性值，basic为空白对照；

图7是pgl3-d7分别于转录因子myod的过表达载体pc-myod和pcdna3.1空白对照共转染于cho细胞24h后相对荧光素酶活性检测结果。图中：纵坐标relatedluciferaseactivity表示相对荧光素酶活性值，pcdna3.1为空白对照，**p<0.01；

图8是转录因子myod结合位点突变型荧光表达载体myod-mut和pgl3-d7野生型载体分别转染cho细胞24h后相对荧光素酶活性检测结果。图中：纵坐标relatedluciferaseactivity表示相对荧光素酶活性值，d7为对照组，**p<0.01。

具体实施方式

实施例1确定mir-27a基因的核心启动子

1、小鼠血液dna提取与检测

1.1利用百泰克细胞/组织基因组dna提取试剂盒(离心柱型)来进行小鼠血液全基因组dna的提取，提取的dna于-20℃保存备用。

1.2基因组dna浓度测定：使用nanodrop2000型dna/rna浓度测定仪，测定dna浓度和od值，按照所测浓度将管中的dna做相应稀释，以50ng/μl分装，于-20℃保存备用。

1.3基因组dna质量检测：取3μldna，加4μl上样缓冲液，混匀后点样于1％的琼脂糖凝胶(eb染色液)上，同时点5μl标准分子量dl2000dnamarker作为参照。15v/cm条件下电泳，然后在凝胶成像系统中观察结果并拍照保存。

2、mir-27a启动子生物信息学分析

根据genebank小鼠mir-27a前体的序列(登录号nc_000074.6)，利用ncbi数据库检索工具往前延伸2000bp，以此序列为模板获得小鼠mir-27a前体的5’-utr区片段，其核苷酸序列如序列表seqidno：1所述。利用tess、jaspar及methprimer等生物信息学软件对序列seqidno：1预测其核心启动子区域、顺反式作用元件及cpg岛分布情况。根据这些预测的信息综合考虑确定缺失片段引物设计的范围。

3、引物设计

以mir-27a前体启动子区为模板，利用primer5软件设计用于扩增获得mir-27a前体8段缺失片段(d1-d8)的touch-downpcr引物(5’端分别添加nheⅰ和hindⅲ酶切位点见引物中方框部分，之前的3个碱基为保护碱基)，其序列如下：

d1上游引物pf1的序列：ctagctagccttgctttcctttgcctttc(序列表seqidno：2)；

d2上游引物pf2的序列：ctagctagcgaaagaaacctgtcatctctccaa(序列表seqidno：3)；d3的上游引物pf3的序列：ctagctagctggcacgcaggacactactcta(序列表seqidno：4)；

d4的上游引物pf4的序列是ctagctagcaactcatcatgtagcttaagca(序列表seqidno：5)；

d5的上游引物pf5的序列：ctagctagctttcctcctgcccttca(序列表seqidno：6)；

d6的上游引物pf6的序列：ctagctagcaagtagaggagggctagggt(序列表seqidno：7)；

d7的上游引物pf7的序列：ctagctagcatgctccaatctcactgtctc(序列表seqidno：8)；

d8的上游引物pf8的序列：ctagctagctcactgtgcctcggacggct(序列表seqidno：9)；

共同下游引物pr的序列：cccaagctttttgctgtggaccttgctca(序列表seqidno：10)。

4、扩增mir-27a启动子缺失片段和pcr产物回收

利用设计的引物seqidno：2到seqidno：9分别与seqidno：10形成引物对，以小鼠血液全基因组dna为模板，采用touch-downpcr策略扩增mir-27a启动子的8段缺失片段(产物长度分别为1698bp、1493bp、1279bp、1088bp、800bp、478bp、283bp和214bp)。

touch-downpcr反应程序如下：

pcr反应体系(50μl)如下：

5、取5μlpcr扩增产物，加0.5μlloadingbuffer，混匀后点样于2％的琼脂糖凝胶上，以5μldna标准分子量dl2000marker作为参照，15v/cm电泳，电泳结束后，在凝胶成像系统中观察结果并拍照保存。

pcr产物采用omegabio-tek公司的凝胶回收试剂盒切胶回收，具体操作步骤按照该试剂盒说明书进行。

6、克隆并测序验证

回收后的pcr产物连接takara公司的pmd18-t载体，连接反应总体系10μl，置于16℃条件下连接1h。

pcr反应体系(10μl)：

无菌条件下取10μl连接产物加入到50μldh5α感受态细胞中，混匀后静置冰浴30min，42℃热激90s，立即置于冰上2-3min，加入400μl不含amp抗生素的lb液体培养基，置于37℃恒温摇床培养45min，低速离心(<5000g)，留150μl上清，其余弃除。将剩余上清吹打混匀然后均匀涂布于平板(含有100mg/l的amp)上，平放于37℃恒温培养箱中约1h，之后倒置过夜培养。用小枪头挑取平板上形态正常的单菌落，置于含400μllb液体培养基(含100mg/lamp)的1.5mlependorff管中，于37℃恒温摇床培养8h。取lμl菌液作为pcr扩增的模板，pcr扩增体系和程序参见前面所描述的步骤。pcr扩增产物用浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像系统中拍照记录。经菌液pcr检测，结果为阳性的含重组质粒的菌液送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，测序结果进行比对可知克隆成功。

7、构建mir-27a启动子缺失片段荧光素酶报告载体

7.1载体pgl3basic扩增，载体pgl3basic含有海肾荧光素酶基因(图3)，经过大肠杆菌dh5α扩增后，使用去内毒素质粒小量提取抽提试剂盒(omegae.z.n.a.tmendo-freeplasmidminikitispin)进行抽提载体dna，具体步骤见试剂盒说明书。

7.2双酶切

由6中抽提的pgl3basic质粒和5中回收纯化的pcr产物，分别用限制性内切酶nheⅰ和hindⅲ进行双酶切，所用内切酶均购自neb。

双酶切反应体系(10μl)：

体系于37℃酶切3h。酶切产物在2％琼脂糖凝胶电泳，采用过柱离心的方法回收。

7.3连接

将酶切后纯化的载体pgl3basic和mir-27a的8个缺失片段(图5)，用t4连接酶16℃连接2h。

连接体系(10μl)：

7.4克隆并测序验证

采用6中的方法进行重组pgl3载体的克隆和测序验证。

7.5重组质粒的抽提

使用去内毒素质粒小量提取抽提试剂盒(omegae.z.n.a.tmendo-freeplasmidminikitispin)进行抽提载体dna，具体步骤见试剂盒说明书。

8、mir-27a缺失片段荧光素酶报告载体的应用

8.1利用荧光素酶报告载体转染cho细胞

(1)在转染前1天，5×10⁴细胞接种于24孔板内，继续培养至细胞密度到80％；

(2)将每孔转染的0.8μg质粒加入50μlopti-mem培养基中混匀，取2.0μllipofectamine2000和1/20μgprl-tk(图3)加入50μlopti-mem培养基中混匀，室温静置5min；

(3)将(2)中的两份混合液混合均匀，室温静置20min。

(4)期间吸除各孔中原有的细胞培养基，用opti-mem清洗两遍。

(5)将每孔细胞加入(3)中混合液100μl，后用opti-mem补至为500μl。

(6)置于37℃，5％co2细胞培养箱培养24h后收集细胞，利用1×plb(passivelysisbuffer)裂解细胞，获得的蛋白置于-70℃冰箱中保存。

8.2双荧光素酶活性检测

利用reporterassaysystem在多功能酶标仪中检测荧光载体的相对荧光活性：吸取10μl获得的细胞裂解液加入酶标板中，首先加入50μl的larⅱ读取样品中荧火虫荧光素酶的活性值a，加入50μl的stop&gloreagent读取样品中海肾荧光素酶的活性值b。a/b比值即代表该荧光载体的活性，采用sas8.0软件对所得结果进行单因素方差分析，p<0.05时为差异显著，p<0.01时为差异极显著。8个mir-27a缺失片段的相对荧光活性检测结果如图5所示。结果表明，pgl3-d1、pgl3-d2、pgl3-d3、pgl3-d4、pgl3-d5、pgl3-d6和pgl3-d7在cho细胞中相对于空白对照pgl3-basic荧光活性都有显著升高，说明在前7个缺失片段区域都有较强的启动子活性，pgl3-d8相比空白对照pgl3-basic无显著性差异。因此pgl3-d7是mir-27a的核心启动子，其序列为：atgctccaatctcactgtctcttctttctctctttaggtgctacactccgctcccacctgctgcccccc，且所述启动子的区域内存在能够上调mir-27a启动子活性的转录因子结合位点。

实施例2、确定mir-27a基因的核心启动子内转录因子myod结合位点的方法

1、过表达转录因子myod对mir-27a核心启动子荧光活性的调控作用

将准备好的myod过表达载体pc-myod和mir-27a的核心启动子双荧光素酶报告载体pgl3-d7瞬时共转染于cho细胞，待24h后进行双荧光素酶活性检测，结果表明(图7)，myod的过量表达可以显著提高mir-27a核心启动子的荧光活性，myod具有促进mir-27a启动活性的能力。

2、转录因子myod结合位点突变型荧光素酶报告载体的活性检测

利用定点突变技术改变2个myod结合位点的共有部分，序列分别如序列表seqidno：21所示，构建突变型荧光表达载体pgl3-d7-mut。以未突变的野生型pgl3-d7为对照，瞬时转染cho细胞，结果发现(图8)：转录因子myod位于mir-27a核心启动子区内的结合位点一经突变，其突变型双荧光素酶表达载体的荧光活性显著下降，表明其丧失了与转录因子myod的结合能力，从而失去了转录因子对启动子的激活功能。因此，确定mir-27a基因的核心启动子内转录因子myod结合位点即为经突变的位点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明所涉及的序列表如下：

seqidno：1

accagcccgaccctgatgttttataaagaagacgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgttgtctggtctttgtgcatgacagtgcagtacactcagagaccagaagagggagtgaaatccccagaagctggagttacaggtagttgtgacaggtgctgagatccaaactcgggccctctgcaagagcagtagccactcttaaccactgagtcagctctttatctgaaacaaggtcacttgtgtcactatgtagccctggatggtctgaaactccctacacagaccaagctggccttgaactcttagagatagtactgtccaaggcctggttcttgctttcctttgcctttcaagtgctgggactaacagtgtgcaccaccattcttaagtttatttttattgtctgtttgtgaatgtttgcttacgcgtacgtctgtgcaccatatgtatgcctggtacccacaggggccagtggggagcgttggagctcttgggaatggagctatagatagctgtgcttgtcatgtaggttctgggaaagaaacctgtcatctctccaacattgaaattctttaaacaatttttaaaaattgtgtgtgtgtgttcccaagtgcagagatcagaggacaacttgcaagggtccgtatgcttttcttcttcgtggttcttgggtttgagctcagggcattgggctccatagcagctctgctcacttgctggatcagcttgctggcccctgaaaactttaactggcacgcaggacactactctacattgggtaggccccaaattttgtggcttgccctggtactgggtgctaaataccttctctgtaagttttcactggccttcctagtagaaggtttggggttttgttgttttatttttgtttttcttctatttaagactagggtctcaaactgtagcccagttaggcctaaaactcatcatgtagcttaagcaggcttttgactccattcttggcaaccttcctgcctcagtttcctcaatgctgagataaacgtgagccaccaactgcaactgttgtagtctgctttacagatggggaaactgaggcttggaaggcctaggggaaactttactgaggtgttattgttggggtgcatcggcctgcttctccttgcttgggccctaggtggtgtggggtgggggtggggttatgtctgagctggctggggaggagagggctgaggtgggaggccctggagtttcctcctgcccttcaggcttctaggaagtggcgccagctggggtgaggtcacttcctccctccaaccgtccacctccctcagcttcctctccatggccccatttggcctgctttgggctcagggctgtgggtggggatagaagcagagtgggaagcagctgggaaggctctgcagcccctttggccttagggcttcaggcacctcccgctttgtagggctggggtagaggcactgctgggtgcccagcatccagcagcctcgctccaaccttcctacggatcgatgctcctcttttttgggaatgcttcttccctcttggaagtagaggagggctagggtgtggatcagcaagctgagtttagattctgtccccagcaccacttaaactgtgtgtggtgaggtgtacctataatcctagactccagaggtagaggcaggaagaactggtgcattcggaaaccttgtgttcagctatgtgagacccagcctggtcaagataggcaggcaagcaagaatgctccaatctcactgtctcttctttctctctttaggtgctacactccgctcccacctgctgcccccctcactgtgcctcggacggctggggttcctggggatgggatttgatgccagtcacaaatcacattgccagggatttccaactgaccctgtgctctgccttgggggctcctgtcgccaaggatgtctgtcttgggtactgggtaacagagaagcctatcatgacaac

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