本发明属于烟草及烟草制品的安全性生物学评价技术领域，具体涉及一种用于检测胶基型嚼烟对细胞DNA损伤的方法。
背景技术：
DNA损伤有多种形式，如DNA单链断裂、DNA与DNA的交联、DNA与蛋白质的交联、DSBs等。其中，DSBs会影响DNA双螺旋结构，被认为是DNA损伤最严重的形式，这种损伤若不被及时修复或被错误修复，会导致DNA遗传物质发生转变从而引发肿瘤及遗传性损伤。DSBs发生后，位于DSBs附近的磷脂酸激酶3肌醇家族成员迅速聚集于DNA断裂发生位点磷酸化形成γH2AX，它被认为是一种早期检测DSBs的最有效的生物学标志物。
胶基型嚼烟是一种以烟草或烟草提取物为有效组分，以可食用胶基为载体，通过咀嚼方式向人体递送烟碱的新型烟草制品。咀嚼过程中烟草或烟草提取物及其他食品添加剂缓慢释放到唾液中，其释放方式有别于传统卷烟和含烟叶原料的Snus型口含烟，因此，有必要针对胶基型嚼烟自身特点建立适合于胶基型嚼烟对细胞DNA损伤的检测方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测胶基型嚼烟对细胞DNA损伤的方法，为胶基型嚼烟的安全性评估提供参考。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为体积百分数。
一种用于检测胶基型嚼烟对细胞DNA损伤的方法，包括如下步骤：
步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；
步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm2生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；
步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；
步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为2mL/孔接种到细胞培养板中，之后将细胞培养板置于37℃、5%CO2培养箱内培养24h；
步骤（5），受试物暴露：受试物分为三组：细胞对照组、样品测试组和阳性对照组；移除步骤（4）中细胞培养板内的培养基，再按上述方法进行分组；在细胞对照组和阳性对照组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基，同时，在阳性对照组的孔内加入依托泊苷，使其终浓度为2μM；在样品测试组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基和步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%；阳性对照组、细胞对照组和样品测试组的终体积为2mL/孔；之后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育24h；
步骤（6），收集细胞：每孔分别收集细胞，具体的收集方式为：首先收集步骤（6）中的培养液，之后贴壁细胞用1mL 0.25%胰酶消化后连同收集的培养液一起离心，弃上清液，收集细胞；
步骤（7），细胞固定：向步骤（6）每孔收集到的细胞中分别加入1ml 预冷至4℃的体积浓度为70%的乙醇，吹打至均匀，4℃固定1h；离心，弃上清，再分别加入500μl预冷至4℃的PBS缓冲液，重悬细胞，再次离心，弃上清，获得细胞；
步骤（8），封闭：取每孔经步骤（7）获得的细胞加入含0.2% TritonX-100（v/v）、10% FBS（v/v）的PBS 200μL，离心，弃上清，获得细胞；
步骤（9），细胞破膜：取每孔经步骤（8）获得的细胞，加入含0.2％（v/v）TritonX-100、0.1%（w/v）BSA的PBS溶液1ml 重悬细胞，处理固定细胞20 min以使细胞膜通透；之后离心，弃上清；再加入5ml PBS重悬细胞，再次离心，获得细胞；
步骤（10），细胞染色：取每孔经步骤（9）获得的细胞，加入10μg/ml 异硫氰酸荧光素标记的γH2AX 抗体100μL，避光孵育3 h；之后离心，弃上清；再加入300μL PBS重悬细胞；
步骤（11），流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测，获得荧光值；
如阳性对照组荧光值大于细胞对照组荧光值1.5倍，则试验有效，反之，则试验无效，需重新按照步骤（1）-步骤（10）进行试验；在试验有效的情况下，比较样品测试组荧光值和细胞对照组荧光值，如样品测试组荧光值大于细胞对照组荧光值1.5倍，则表明该检测胶基型嚼烟对细胞DNA有损伤，反之，则对细胞DNA无损伤。
进一步，优选的是，步骤（1）所述的研磨方式具体为：研磨棒顺时针研磨1min后逆时针研磨1min，交替进行，研磨速度为30rpm/min。
进一步，优选的是，步骤（1）所述的过滤方法为先用定性滤纸进行初滤，再用0.45μm有机滤膜过滤。
进一步，优选的是，步骤（4）所述的细胞培养板为6孔细胞培养板。
进一步，优选的是，步骤（5）分组时，样品测试组的各个浓度、细胞对照组和阳性对照组均设置3个复孔。
进一步，优选的是，步骤（6）、步骤（7）、步骤（8）、步骤（9）和步骤（10）所述的离心的速度均为1000rpm/min，每次离心时间均为5min。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明综合考察了胶基型嚼烟的暴露途径，作用方式，建立了全新的胶基型嚼烟前处理方法，且根据胶基型嚼烟作用靶细胞选取了人口腔角质细胞HOK作为胶基型嚼烟对细胞DNA损伤的检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合胶基型嚼烟对细胞DNA损伤的检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本发明方法能够准确有效地检测胶基型嚼烟对细胞DNA损伤的真实影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明所采用的口腔角质细胞培养基OKM、磷酸缓冲液、Binding Buffer均为普通的商品化产品。
本发明除非另有说明，否则百分号代表体积百分数，比例为体积比。
实施例1
一种用于检测胶基型嚼烟对细胞DNA损伤的方法，包括如下步骤：
步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；
步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～85%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1min，每25cm2生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；
步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；
步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为2mL/孔接种到细胞培养板中，之后将细胞培养板置于37℃、5%CO2培养箱内培养24h；
步骤（5），受试物暴露：受试物分为三组：细胞对照组、样品测试组和阳性对照组；移除步骤（4）中细胞培养板内的培养基，再按上述方法进行分组；在细胞对照组和阳性对照组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基，同时，在阳性对照组的孔内加入依托泊苷，使其终浓度为2μM；在样品测试组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基和步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%；阳性对照组、细胞对照组和样品测试组的终体积为2mL/孔；之后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育24h；
步骤（6），收集细胞：每孔分别收集细胞，具体的收集方式为：首先收集步骤（6）中的培养液，之后贴壁细胞用1mL 0.25%胰酶消化后连同收集的培养液一起离心，弃上清液，收集细胞；
步骤（7），细胞固定：向步骤（6）每孔收集到的细胞中分别加入1ml 预冷至4℃的体积浓度为70%的乙醇，吹打至均匀，4℃固定1h；离心，弃上清，再分别加入500μl预冷至4℃的PBS缓冲液，重悬细胞，再次离心，弃上清，获得细胞；
步骤（8），封闭：取每孔经步骤（7）获得的细胞加入含0.2% TritonX-100（v/v）、10% FBS（v/v）的PBS 200μL，离心，弃上清，获得细胞；
步骤（9），细胞破膜：取每孔经步骤（8）获得的细胞，加入含0.2％（v/v）TritonX-100、0.1%（w/v）BSA的PBS溶液1ml 重悬细胞，处理固定细胞20 min以使细胞膜通透；之后离心，弃上清；再加入5ml PBS重悬细胞，再次离心，获得细胞；
步骤（10），细胞染色：取每孔经步骤（9）获得的细胞，加入10μg/ml 异硫氰酸荧光素标记的γH2AX 抗体100μL，避光孵育3 h；之后离心，弃上清；再加入300μL PBS重悬细胞；
步骤（11），流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测，获得荧光值；
如阳性对照组荧光值大于细胞对照组荧光值1.5倍，则试验有效，反之，则试验无效，需重新按照步骤（1）-步骤（10）进行试验；在试验有效的情况下，比较样品测试组荧光值和细胞对照组荧光值，如样品测试组荧光值大于细胞对照组荧光值1.5倍，则表明该检测胶基型嚼烟对细胞DNA有损伤，反之，则对细胞DNA无损伤。
其中，步骤（1）所述的研磨方式具体为：研磨棒顺时针研磨1min后逆时针研磨1min，交替进行，研磨速度为30rpm/min。所述的过滤方法为先用定性滤纸进行初滤除渣，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌。
实施例2
一种用于检测胶基型嚼烟对细胞DNA损伤的方法，包括如下步骤：
步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；
步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为85～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育2min，每25cm2生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；
步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；
步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为2mL/孔接种到6孔细胞培养板中，之后将细胞培养板置于37℃、5%CO2培养箱内培养24h；
步骤（5），受试物暴露：受试物分为三组：细胞对照组、样品测试组和阳性对照组；移除步骤（4）中细胞培养板内的培养基，再按上述方法进行分组；在细胞对照组和阳性对照组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基，同时，在阳性对照组的孔内加入依托泊苷，使其终浓度为2μM；在样品测试组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基和步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%；阳性对照组、细胞对照组和样品测试组的终体积为2mL/孔；之后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育24h；
步骤（6），收集细胞：每孔分别收集细胞，具体的收集方式为：首先收集步骤（6）中的培养液，之后贴壁细胞用1mL 0.25%胰酶消化后连同收集的培养液一起离心，弃上清液，收集细胞；
步骤（7），细胞固定：向步骤（6）每孔收集到的细胞中分别加入1ml 预冷至4℃的体积浓度为70%的乙醇，吹打至均匀，4℃固定1h；离心，弃上清，再分别加入500μl预冷至4℃的PBS缓冲液，重悬细胞，再次离心，弃上清，获得细胞；
步骤（8），封闭：取每孔经步骤（7）获得的细胞加入含0.2% TritonX-100（v/v）、10% FBS（v/v）的PBS 200μL，离心，弃上清，获得细胞；
步骤（9），细胞破膜：取每孔经步骤（8）获得的细胞，加入含0.2％（v/v）TritonX-100、0.1%（w/v）BSA的PBS溶液1ml 重悬细胞，处理固定细胞20 min以使细胞膜通透；之后离心，弃上清；再加入5ml PBS重悬细胞，再次离心，获得细胞；
步骤（10），细胞染色：取每孔经步骤（9）获得的细胞，加入10μg/ml 异硫氰酸荧光素标记的γH2AX 抗体100μL，避光孵育3 h；之后离心，弃上清；再加入300μL PBS重悬细胞；
步骤（11），流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测，获得荧光值；
如阳性对照组荧光值大于细胞对照组荧光值1.5倍，则试验有效，反之，则试验无效，需重新按照步骤（1）-步骤（10）进行试验；在试验有效的情况下，比较样品测试组荧光值和细胞对照组荧光值，如样品测试组荧光值大于细胞对照组荧光值1.5倍，则表明该检测胶基型嚼烟对细胞DNA有损伤，反之，则对细胞DNA无损伤。
其中，步骤（1）所述的研磨方式具体为：研磨棒顺时针研磨1min后逆时针研磨1min，交替进行，研磨速度为30rpm/min。所述的过滤方法为先用定性滤纸进行初滤除渣，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌。
实施例3
一种用于检测胶基型嚼烟对细胞DNA损伤的方法，包括如下步骤：
步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；
步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为85～88%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1.2min，每25cm2生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1.2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；
步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；
步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为2mL/孔接种到6孔细胞培养板中，之后将细胞培养板置于37℃、5%CO2培养箱内培养24h；
步骤（5），受试物暴露：受试物分为三组：细胞对照组、样品测试组和阳性对照组；移除步骤（4）中细胞培养板内的培养基，再按上述方法进行分组；在细胞对照组和阳性对照组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基，同时，在阳性对照组的孔内加入依托泊苷，使其终浓度为2μM；在样品测试组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基和步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%；阳性对照组、细胞对照组和样品测试组的终体积为2mL/孔；之后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育24h；具体加样如表1所示。
表1
步骤（6），收集细胞：每孔分别收集细胞，具体的收集方式为：首先收集步骤（6）中的培养液，之后贴壁细胞用1mL 0.25%胰酶消化后连同收集的培养液一起离心，弃上清液，收集细胞；
步骤（7），细胞固定：向步骤（6）每孔收集到的细胞中分别加入1ml 预冷至4℃的体积浓度为70%的乙醇，吹打至均匀，4℃固定1h；离心，弃上清，再分别加入500μl预冷至4℃的PBS缓冲液，重悬细胞，再次离心，弃上清，获得细胞；
步骤（8），封闭：取每孔经步骤（7）获得的细胞加入含0.2% TritonX-100（v/v）、10% FBS（v/v）的PBS 200μL，离心，弃上清，获得细胞；
步骤（9），细胞破膜：取每孔经步骤（8）获得的细胞，加入含0.2％（v/v）TritonX-100、0.1%（w/v）BSA的PBS溶液1ml 重悬细胞，处理固定细胞20 min以使细胞膜通透；之后离心，弃上清；再加入5ml PBS重悬细胞，再次离心，获得细胞；
步骤（10），细胞染色：取每孔经步骤（9）获得的细胞，加入10μg/ml 异硫氰酸荧光素标记的γH2AX 抗体100μL，避光孵育3 h；之后离心，弃上清；再加入300μL PBS重悬细胞；
步骤（11），流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测，获得荧光值；
如阳性对照组荧光值大于细胞对照组荧光值1.5倍，则试验有效，反之，则试验无效，需重新按照步骤（1）-步骤（10）进行试验；在试验有效的情况下，比较样品测试组荧光值和细胞对照组荧光值，如样品测试组荧光值大于细胞对照组荧光值1.5倍，则表明该检测胶基型嚼烟对细胞DNA有损伤，反之，则对细胞DNA无损伤。
其中，步骤（1）所述的研磨方式具体为：研磨棒顺时针研磨1min后逆时针研磨1min，交替进行，研磨速度为30rpm/min。所述的过滤方法为先用定性滤纸进行初滤除渣，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌。
步骤（5）分组时，样品测试组的各个浓度、细胞对照组和阳性对照组均设置3个复孔。样品测试组的各个浓度、细胞对照组和阳性对照组的荧光值计算时，分别取平均值。
步骤（6）、步骤（7）、步骤（8）、步骤（9）和步骤（10）所述的离心的速度均为1000rpm/min，每次离心时间均为5min。
应用实例
分别采用本发明实施例3方法对市售的三种胶基型嚼烟制品的进行检测，结果如表2。
表2.3种胶基型嚼烟对HOK细胞DNA损伤标志物γH2AX荧光值的影响
结果如表2所示：由表2可以看出，阳性对照组荧光值大于细胞对照组荧光值1.5倍，阳性对照对细胞DNA有损伤，证明试验体系正常。随着样品测试组受试剂量的增高，胶基型嚼烟1#、2#、3#样品在检测剂量范围内（10%-50%）样品测试组荧光值不大于细胞对照组荧光值1.5倍则表明样品对细胞DNA无损伤，即对HOK细胞DNA损伤标志物γH2AX荧光值无影响，由此可见，本方法能够有效的测定胶基型嚼烟对受试细胞DNA损伤的影响。
本发明胶基型嚼烟的样品前处理方法通过模拟胶基型嚼烟的溶出方式最大限度的反映了真实使用状态，能够准确有效的检测胶基型嚼烟对细胞DNA损伤的真实影响。
本发明综合考察了胶基型嚼烟制品的暴露途径，作用方式，建立了全新的胶基型嚼烟制品处理方法，且根据胶基型嚼烟制品作用靶细胞选取了人口腔角质细胞HOK作为DNA损伤试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合胶基型嚼烟制品对细胞DNA损伤的检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本发明方法能够准确有效地检测胶基型嚼烟制品对细胞DNA损伤的影响。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。