一株去除羊粪恶臭的芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一株去除羊粪恶臭的芽孢杆菌(bacillussp.)及其应用。技术背景我国肉羊集约化养殖逐年增加。集约化养殖所产生的大量粪便，可释放大量的恶臭气体，包括氨气、挥发性脂肪酸(vfas)、吲哚、粪臭素等。这些恶臭物质不仅影响羊舍内动物和人的健康，而且释放到空气中，造成空气污染，影响附近居民的生活。目前如何高效而廉价地去除恶臭气体，降低其对动物、人和环境带来的危害，已经成为养殖行业的重大问题。已有报道，蚯蚓粪可有效地去除恶臭物质，因为蚯蚓粪中含有可去除恶臭物质的微生物。所以本发明将蚯蚓腔内中可以有效快速地去除恶臭物质的微生物分离出来，经扩大培养，添加羊粪中以去除恶臭物质。技术实现要素：本发明的目的是为了解决羊舍粪便恶臭的问题，提供了一种对羊粪恶臭物质有高效去除能力的芽孢杆菌及其应用，本发明还提供一种去除羊粪恶臭物质的方法和微生物菌剂。本发明是这样实现的：首先利用羊粪浸提液琼脂培养基从蚯蚓腔内容物中初步筛选得到22株能在羊粪中生长繁殖的微生物菌株，再通过复筛获得一株具有高效去除恶臭物质功能的微生物菌株，申请人将其编号为w15，经16srdna鉴定后，在genebank中经blast后，与芽孢杆菌相似达99％。于2017年12月12日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，其保藏号为：cctccno:m2017786，分类命名为bacillussp.w15。随后将芽孢杆菌w15菌株扩大培养后，接种于羊粪中，感官评价其去除恶臭的能力。结果表明：w15菌株对羊粪恶臭去除效果显著，感官评价显示，恶臭等级降低了1个等级。该菌株能有效去除羊粪恶臭物质，尤其是nh3、支链脂肪酸、吲哚，因此可扩增培养后，将菌液接种至羊粪中从而去除羊粪恶臭。本发明所提供的菌株丰富了除臭微生物的资源，该菌株可用作去除羊粪恶臭的微生物菌剂的活性成分。更详尽的技术方案见《具体实施方式》所述。附图说明图1：w15菌株对羊粪中乙酸的去除效果。图2：w15菌株对羊粪中丙酸的去除效果。图3：w15菌株对羊粪中正丁酸的去除效果。图4：w15菌株对羊粪中异丁酸的去除效果。图5：w15菌株对羊粪中正戊酸的去除效果。图6：w15菌株对羊粪中异戊酸的去除效果。图7：w15菌株对羊粪中吲哚的去除效果。图8：w15菌株对羊粪中对甲酚的去除效果。图9：w15菌株对羊粪中粪臭素的去除效果。图10：w15菌株的16srdna序列信息。具体实施方式以下是结合实施例对本发明作的进一步阐述。需要说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。本发明中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。本发明所涉及的培养基配方如下：羊粪浸提液琼脂培养基：500g羊粪加入800ml蒸馏水中，充分搅拌后，八层纱布过滤，取500ml浸提液加入10g琼脂。pda培养基：马铃薯浸粉6.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml。营养肉汤：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉3.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000ml。实施例1除臭微生物的初步筛选在肥沃的土壤中，挖取蚯蚓。蚯蚓外表用医用酒精消毒后，用解剖剪将其腔剪开，取出腔内容物于20ml无菌生理盐水中，搅拌均匀后，经适当稀释，涂布于羊粪浸提液琼脂培养基平板上。30℃倒置培养48h，挑取形态不同的单菌落，划线于试管pda斜面培养基，分别命名w1～w22，共22株单菌株。将22株单菌株接种于营养肉汤培养基中，30℃，100r/min摇床震荡培养36h，得菌液备用。称取50g新鲜羊粪于500ml锥形瓶中，按10％的接种量，接种菌液。每株菌株3个平行。再用橡胶塞把锥形瓶密封，30℃恒温培养，每隔5天感官评价各菌株的除臭效果。其中w7、w15均有除臭效果，但w15效果最为明显。实施例2除臭微生物的复筛将初筛所得有除臭效果的w7、w15等菌株用营养肉汤培养基扩大培养，30℃，100r/min摇床震荡培养36h，得菌液备用。称取200g新鲜羊粪于1000ml锥形瓶中，按10％的接种量，接种菌液，每株菌株5个平行，同时以不进行任何处理的新鲜羊粪为对照。再用橡胶塞把锥形瓶密封，用0.005n的稀硫酸溶液收集氨气，30℃恒温培养，每5天感官评价各菌株的除臭效果，并检测收集的氨气质量(nh3)，取样检测羊粪中挥发性脂肪酸(vafs)、吲哚、粪臭素、对甲酚等恶臭物质含量。感官评价分6个等级：0～5，依次为无臭、微臭、明显臭、很臭、非常臭、难以忍受的臭。感官评价法显示w15菌株降低了1个恶臭等级，除臭效果显著(表1)。该菌株对nh3去除效果见表2，最高去除率达82.19％，15天的总去除率为76.03％，效果显著。表1w15菌株除臭效果的感官评价时间(d)对照w15w752.2+0.30.9+0.41.2+0.2102.0+0.20.8+0.11.5+0.3151.4+0.30.8+0.31.3+0.2表2w15菌株对nh3的去除效果时间(d)对照(μg)w15(μg)去除率％w7(μg)去除率％5122.50±17.3321.81±5.0782.1991.88±33.2025.0010125.00±5.0929.75±10.8876.20177.00±25.02-41.601528.58±4.4014.63±2.1748.8321.29±3.5925.51总量276.0866.1976.03290.17-5.10从图1-6可以看出，w15对vfas中的支链酸如异丁酸、异戊酸去除效果显著，而支链vfas比直链vfas的臭味阈值更低，对恶臭强度的贡献更大，所以降低支链vfas含量，除臭效果更好。w15对吲哚有显著的去除效果，对粪臭素和对甲酚效果不显著。实施例3菌株w15的鉴定采用分子生物学方法对上述筛选得到的w15菌株进行鉴定，将该菌株送往测序公司进行16srdna序列测定，将所测序列与genbank数据库中的序列进行blast比对，结果表明，该菌株与芽孢杆菌(bacillussp.)相似度为99％以上。当前第1页12