本发明涉及病毒检测技术领域，尤其是一种快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的引物和探针、方法。
背景技术：
猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea,ped)是由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,pedv)引起的以腹泻、呕吐和脱水为典型特征的一种急性高度接触性肠道传染病。哺乳仔猪、架子猪或育肥猪等各种年龄的猪均易感，但哺乳仔猪受害最为严重，死亡率最高可达100％。自从1971年英国首次报道猪流行性腹泻(ped)以来，相继在比利时、德国、加拿大、日本、瑞士等多个国家报道了本病的发生，我国从1976年开始就陆续有ped的报道，但临床危害较轻。该病2010年在我国大规模暴发，由于其发病率高、死亡率高(初生仔猪因水样腹死亡率可高达100％)，传播迅速，短短几年时间，造成我国生猪存栏量持续走低，给我国生猪养殖造成巨大经济损失的同时，也严重影响了国计民生。2014年该病由东南亚、东北亚逐步蔓延至美国(美国自2013年5月在爱荷华州发生ped以来的一段时间，每周损失10万头仔猪)、加拿大、墨西哥、乌克兰等欧美国家，给全球生猪养殖业造成灾难性损失，当前，该病仍呈全球流行态势。
由于弱毒疫苗的广泛使用(中国：cv777；韩国kped-9；日本：83p-5；美国：pedv)，通过抗体检测很难确定猪群的实际感染情况，加之该病病原极难分离培养，因此对病原的分子检测便成为评估该病流行、发生态势及生物安全防控是否有效的主要手段。虽然pedv所有分离株都呈单一血清型，但其主要抗原表位基因(纤突糖蛋白：s基因)却呈现不同区域特征，这其中以中国流行毒株多样性尤为明显(我国北方毒株与韩国、美国等地新发毒株相近、我国南方部分毒株与泰国等东南亚国家相近)。传统的病原检测技术很难将疫苗毒排毒与野毒感染进行区别(我国目前使用的疫苗毒虽然orf3有部分缺失，可以作为pcr鉴别标记，但也存在韩国kpedv-9在中国部分地区非法使用的情况，kped-9无orf3缺失)，更无法对流行的基因型进行鉴定。
技术实现要素：
基于此，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：
作为本发明的第一个方面，本发明提供了快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下：
上游引物：gaacccactaacttgggtgt(seqidno：1)；
下游引物：aggttcaacaatctcaacta(seqidno：2)；
探针：atctggacctgctgttgccattgcc(seqidno：3)，其中，所述探针的5‘端结合荧光报告基团，所述探针的3‘端结合荧光淬灭基团。
优选地，所述荧光报告基团为fam、hex、vic、cy5或tet，所述荧光淬灭基团为tamra、mgb或bhq。
作为本发明的第二个方面，本发明提供了快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的试剂盒，所述试剂盒含有上述的引物和探针。
作为本发明的第三个方面，本发明提供了快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的方法，包括以下步骤：
1)从样品中提取病毒核酸；
2)以核酸为模板，利用上述的引物和探针，进行rt-pcr扩增反应获得扩增产物；
3)对扩增产物进行hrm分析，确定病毒的基因型。应当说明的是，上述方法并非用于猪流行性腹泻的诊断和治疗。
优选地，所述rt-pcr扩增的反应体系为：
其中，所采用的酶优选primescript1stepenzymemix。
优选地，所述步骤2)中rt-pcr扩增的反应程序如下：50℃反转录30min；95℃预变性3min；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸20s；循环45次。
优选地，所述步骤3)hrm分析过程中，45℃到60℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
优选地，所述步骤3)hrm分析的具体判定标准为：以不同基因型pedv质粒样品作为阳性对照，对被检样品进行分型鉴定，当被检样品和阳性对照中某种基因型的pedv质粒之间探针峰的δtm值小于0.5℃时，判定被检样品和所述某种基因型的pedv质粒为同一基因型。
优选地，所述不同基因型pedv包括4种基因型，分别为：cv777疫苗毒株、kped-9疫苗毒株、pedv/north野毒株和pedv/south野毒株。
综上所述，本发明的有益效果为：
采用本发明的引物、探针和方法检测不同基因型的猪流行性腹泻病毒，特异性高、重复性好、灵敏度高，可快速准确地检测出猪流行性腹泻病毒的基因型；该检测方法省时省力，可信度高，为pedv毒株的分离、鉴定以及后期弱毒疫苗的研发奠定了坚实的基础。
附图说明
图1为pedv进化分型图；
图2为4个基因型pedv标准样品峰型化熔解曲线图；
图3为采用pedv-hrm分析方法检测本发明的引物特异性的试验结果；
图4为实施例2的方法的pedv/south野毒株荧光定量hrm灵敏度试验结果；
图5为实施例2的方法的pedv/north野毒株荧光定量hrm灵敏度试验结果；
图6为实施例2的方法的kped-9疫苗毒株荧光定量hrm灵敏度试验结果；
图7为实施例2的方法的cv777疫苗毒株荧光定量hrm灵敏度试验结果；
图8为pedv四种不同基因型临床样品采用实施例2的方法检测的hrm峰型化熔解曲线图。
具体实施方式
为了控制pedv的流行，需要建立一种快速鉴别pedv疫苗毒株(cv777、kped-9)与临床野毒，北方毒株(s基因含4161bp碱基)与南方毒株(s基因含4158bp碱基)的基因型的方法。本申请以pcr-高分辨熔解曲线分析技术(hrm)为技术依托，建立了一种基于探针的pedv不同基因型熔解曲线分型检测技术，为pedv的临床综合防控提供技术支撑。
本申请的发明人对ncbi数据库中已公布的pedv核酸序列进行多序列比对分析，寻找适合于区分pedv疫苗毒株(cv777、kped-9)与临床野毒株(north、south)的差异化位点，设计探针，建立区分pedv四个基因型的实时荧光定量熔解曲线分析方法，通过对临床样品的检测结果，分析本发明的引物、探针、检测方法在临床检测中的应用价值。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1hrm引物和探针
根据2010-2014年临床鉴定的42例pedv阳性病料s基因序列与ncbi中已公布的s基因序列的遗传进化分析结果，将pedv分为四个基因型(如图1)。将genbank中公布的pedv全基因组序列依据不同基因型进行序列比对(blastx、bioedit、mega等)，找到2株疫苗毒/野毒，中国南方流行毒株/北方流行毒株的特异性位点突变及信息，并以此为基础设计合引物及探针。
本申请的发明人经过对所设计的大量引物和探针进行筛选后，发现采用下列hrm引物和探针检测猪流行性腹泻病毒的基因型的效果最好，其核苷酸序列如下所示：
上游引物：gaacccactaacttgggtgt(seqidno：1)；
下游引物：aggttcaacaatctcaacta(seqidno：2)；
探针：6fam-atctggacctgctgttgccattgcc-bhq1(seqidno：3)。
实施例2快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的方法
本发明的快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)样品制备
cv777疫苗毒株、kped-9疫苗毒株分别购自哈尔滨维科生物技术开发公司及一集约化猪场；pedv野毒样本(north；south)为本实验室经rt-pcr、测序、遗传进化分析后保存；临床检测样品(粪便或肠道内容物)来源于2012－2016年暴发仔猪腹泻的猪场，分别从上述病毒样本中提取核酸。
(2)rt-pcr反应及hrm分析
按以下组成配制rt-pcr反应液，对照
反应程序为50℃反转录30min；95℃预变性3min；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸20s；循环45次。hrm运行程序：95℃变性10秒，45℃到60℃以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
为了验证引物和探针设计的准确性，进行了cv777疫苗毒株、kped-9疫苗毒株、pedv/north野毒样本、pedv/south作为标准样品的pcr-hrm分析，了解其高熔解曲线图的tm特性，结果如图2所示，pcr-hrm分析结果显示，pedv/korea疫苗株探针峰tm值较低，为59.38℃，pedv/china疫苗株探针峰tm值为68.54℃，pedv/south探针峰tm值为65.19℃，pedv/north探针峰tm值为72.67℃，说明四个基因型pedv探针峰tm差异极明显(约4－5℃)，因此，实施例1的引物和探针完全可以用于检测猪流行性腹泻病毒的基因型。
获得不同基因型临床样品hrm峰型化熔解曲线图后，判断被检测样品的基因型的标准为：以4个基因型pedv(cv777疫苗毒株、kped-9疫苗毒株、pedv/north野毒株和pedv/south野毒株)质粒样品作为阳性对照，对临床被检样品进行分型鉴定，当被检样品和阳性对照之间探针峰δtm值小于0.5℃时，判定两者为同一基因型。
实施例3特异性试验分析
试验方法：以猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪轮状病毒(rv)、猪捷申病毒(ptv)的核酸为模板进行rt-pcr扩增，通过荧光定量pcr扩增峰验证引物的特异性。
图3为采用pedv-hrm分析方法检测本发明的引物特异性的试验结果。从图3可看出，四种不同基因型毒株的核酸中均能特异性扩增出pedv熔解峰，而其它常见病毒，如csfv、tgev、rv和ptv样品均未扩增出熔解峰，表明实施例1的引物及探针特异性高，适合作为hrm分析使用。
实施例4灵敏度试验分析
试验方法：分别以pedv毒株cv777疫苗毒株、kped-9疫苗毒株、pedv/north野毒株和pedv/south野毒株提取核酸为模板，以上述上游引物和下游引物构建质粒，质粒样品分别做1.0x107copies/μl-1.0x100copies/μl的10倍梯度稀释，后以梯度稀释后的质粒为模板进行pcr-hrm分析，确定hrm方法的最低检测下限。
实施例2的方法检测pedv四种不同基因型的灵敏度如图4-图7所示。试验结果显示，四种基因型pedv/south野毒株、pedv/north野毒株、kped-9疫苗毒株和cv777疫苗毒株鉴别时熔解曲线的检测下限为依次为1.0x103、1.0x102、1.0x103、1.0x103copies/μl。考虑到pedv属肠源性病毒，一般临床发病时排毒量极高，因此实施例2的方法灵敏度完全可以用于临床样本的检测工作。
实施例5重复性试验
试验方法：选取pedv野毒株和疫苗毒株标准样品，分别抽提不同批次的rna，用实施例2的方法进行pcr-hrm重复性试验，计算分析样品批内和批间变异系数，以确保实验的重复性。
pedv四种不同基因型荧光定量hrm方法重复性试验结果如表1所示。cv777疫苗毒株、kped-9疫苗毒株、pedv/north野毒样本、pedv/south样品在不同批次抽提核酸后的熔解曲线重复性较高。虽然不同批次样品在熔解温度(tm)上有微弱变化，但其变异系数cv％无显著差异。
表1pedv四种不同基因型hrm方法重复性试验结果
实施例6prrsvpcr-hmr方法的应用
采用本申请建立的pedv四种不同基因型荧光定量hrm方法(即实施例2的方法)对临床样品进行检测，结果如图8所示，可知目前临床pedv临床样本中，以north基因型为主，兼有少许south型样本。
传统的pcr可以通过多重pcr实现对多个不同靶的扩增，再通过电泳来区分不同大小的扩增产物，而实时pcr则只能通过多色荧光检测或tm多重检测来区分不同的靶。多色荧光检测是通过对靶特异的检测探针标记不同波长的荧光基团，使不同的探针实现彼此的区分，从而根据实时pcr各探针荧光信号的升起的情况对不同靶的进行检测。
实现实时pcr多靶同时检测的另一种方式是利用tm多重检测。双链dna在热变性过程中，有50％dna变性解链时的温度称为双链dna的解链温度，又称熔解温度或熔点tm。在溶剂固定的前提下，双链dna的tm值是固定不变的。利用双链dna的这个特性，在实时pcr之后进行熔解曲线分析，就可以检测双链dna的tm值，根据晶值的差异就可以对不同的扩增产物或靶序列进行区分。近年来发展的高分辨熔解曲线分析技术、非标记探针熔解曲线技术，不仅可以区分tm值差异大的pcr扩增产物，还可以区分tm值差异极小的产物，甚至是单碱基差异的产物，故被广泛用于未知突变的筛查、已知突变的检测及基因分型，dna甲基化检测等领域。因此，tm多重检测已成为实现实时pcr多靶检测的重要手段。
本申请中，我们发展了新的探针熔解曲线分析技术，针对目前的荧光探针具有难以同时结合多色荧光检测和多重检测的缺陷，我们系统研究了基于探针的实时pcr用于熔解曲线分析的可行性，以此为基础，我们建立了可用于普通实时pcr仪器的探针熔解曲线分析技术，该技术实现了靶序列多位点变异的检测或识别，通过一条探针不同位点的巧妙设计，实现了pedv四种不同基因型熔解曲线的分型检测(四种不同基因型pedv熔解温度基本相差都在4－5℃)，该检测技术省时省力，可信度高，为pedv毒株的分离、鉴定以及后期弱毒疫苗的研发奠定了坚实的基础。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
sequencelisting
<110>广东省农业科学院动物卫生研究所
<120>快速检测猪流行性腹泻病毒基因型的引物和探针、方法
<130>2017
<160>3
<170>patentinversion3.5
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<212>dna
<213>人工序列
<400>1
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<213>人工序列
<400>2
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<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
atctggacctgctgttgccattgcc25