一种区分GSH、Cys、SO2荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种区分细胞中GSH、Cys、SO2荧光探针及其制备方法和应用，属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术：

氨基酸是构成蛋白质的基本物质，并且与生物的生命活动有着密切的联系。半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)是生物体内常见的巯基化合物，在维持生物的正常生理活动中起着重要的作用。流行病学研究显示，暴露在二氧化硫下不仅可以导致很多呼吸系统疾病，还与肺癌、也血管疾病和许多神经系统疾病有关，如偏头痛、中风和脑癌。不医学研究表明不正常的生理浓度可能引起很多疾病，比如肾功能衰竭、老年痴呆症、帕金森疾病、心血管疾病、冠心病、肌肉损伤、皮肤松弛等，它们在生物体内含量变化可以作为这些疾病诊断的依据。因此，在生理条件下高选择性、高灵敏性地检测小分子生物硫醇是非常重要的，当前已引起广泛的关注及深入研究。

目前已经应用的技术包括高效液相色谱法、毛细管电泳法、电化学检测、光学分析和质谱鉴定，这些方法仅可以在体外监测半胱氨酸、二氧化硫和谷胱甘肽。荧光分子探针不仅灵敏度高选择性好，而且能够在活细胞 中检测分析物，所以研究者们开始关注将荧光分子探针的这项技术应用于对体外和活细胞内的半胱氨酸、二氧化硫和谷胱甘肽进行监测或者细胞荧光成像。目前已经报导了多种基于化学反应的该类荧光探针，例如Michael加成和亲核取代反应等。在这些方法中，利用迈克尔加成使荧光恢复是一种特别有效的方法。由于这三种氨基酸都含有巯基(-SH)并且在结构和反应活性上相差较小，所以这类荧光探针很难将GSH、Cys和SO2区分开，因此研发能够区分细胞中GSH、Cys、SO2的荧光探针是很有必要的。

技术实现要素：

针对现有探针对区分细胞中GSH、Cys、SO2区分度不够的问题，本发明提供一种反应灵敏、检测限低、特异性好的可区分细胞中的GSH、Cys、SO2的荧光探针Co-SO2，可用于评价和研究细胞内GSH、Cys、SO2的生理功能。

本发明的另一目的是提供一种简便地合成上述区分细胞中GSH、Cys、SO2的荧光探针Co-SO2的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种区分GSH、Cys和SO2的荧光探针，简称为Co-SO2，具有如式（I）所示的结构：

式（I）。

一种上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

7-二乙胺基-4-羟基香豆素与POCl3在DMF中加热反应，分离纯化后即得。

所述POCl3与7-二乙胺基-4-羟基香豆素的摩尔比为1-1.2:1。

所述加热温度为70-80℃，加热时间为4-6h。

所述分离纯化操作为反应液倒入冰水，调节pH至中性，析出固体，然后以二氯甲烷：甲醇=40:1（v/v）为淋洗液，使用柱层析提纯。

合成路线如下：

一种上述荧光探针用于检测溶液或细胞中GSH、Cys与SO2的应用。

本发明中荧光探针的识别机理如下：

GSH和Cys的结构如下所示，均能够与本发明所述区分细胞中GSH、Cys、SO2的荧光探针Co-NA发生反应：

。

荧光探针本身由于醛基与氯的拉电子作用，与7-二乙胺基组成强的推拉电子体系，产生绿色的荧光，加入二氧化硫之后，与二氧化硫发生加成取代反应，使得发射波长发生红移，加入Cys之后波长发生蓝移，加入GSH之后波长也发生红移，但是荧光强度高于二氧化硫的。

识别反应如下：

。

本发明具有以下优点：

本发明的Co-NA荧光探针是一种简单，快速，灵敏的区分细胞中GSH、Cys、SO2的探针；在低浓度下即可特异与细胞中GSH、Cys、SO2反应，抗多种活性氧、氨基酸及含巯基化合物的干扰；在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为Co-SO2的¹H NMR谱图；

图2为Co-SO2荧光探针对不同分子或离子的选择性；

图3为不同浓度的SO2下Co-SO2的荧光强度与波长；

图4为Co-SO2荧光探针对细胞内SO2、Cys、GSH荧光图像。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 Co-SO2荧光探针的合成

在0℃下，将DMF(15 mL, 10.0 mmol)加入到100 mL的单口烧瓶中，将POCl3 (2 mL,)逐滴滴加到烧瓶中，在0℃下搅拌30 min后，将化合物7-二乙胺基-4-羟基香豆素溶解在DMF中逐滴滴加到上述溶液中将温度逐渐升高至80℃下反应4 h，反应结束后将反应液冷却至室温，然后倒入冰水中，调节pH至中性得化合物析出大量固体，将固体过滤，使用柱层析提纯（二氯甲烷：甲醇=40:1，v/v），最终获得黄色化合物Co-SO2；其¹H NMR谱图如图1所示。

实施例2 Co-SO2荧光探针对不同分子或离子的选择性

将实施例1中Co-SO2荧光探针配制成浓度为1 mM的母液。

将下列物质Br^-, ClO^-, Cu²⁺, F^-, Fe²⁺, H2O2, HClO, Hg²⁺, HPO4^2-, Mg²⁺ , N^3-, Na⁺, Na2S, NaHS, NO^2-, NO^3-, OAC^-, ONOO^-, S2O3^2-, SCN^-, SO4^2-, Zn²⁺, 单线态氧, SO2, GSH, Hcy , Cys以磷酸缓冲液（0.01 mM，pH=7.4）配制成5 mL浓度为40 mM的母液。

取28支试管，分别加入25 μL探针母液、225 μL DMSO和各离子或分子的母液，对照以等量水代替干扰物质；用磷酸缓冲液（0.01 mM，pH=7.4）定容至5 mL，使各离子或氨基酸的终浓度为3 mM，活性氧和活性氮的终浓度为100 mM。各溶液摇匀后进行荧光检测（λex = 460 nm, λem = 575 nm）；55 s后再次检测（λex =460 nm, λem = 575 nm）。以575nm荧光强度为纵坐标，以不同分子或离子为横坐标作图2；其中，1-28分别为Co-SO2, Br^-, ClO^-, Cu²⁺, F^-, Fe²⁺, H2O2, HClO, Hg²⁺, HPO4^2-, Mg²⁺ , N^3-, Na⁺, Na2S, NaHS, NO^2-, NO^3-, OAC^-, ONOO^-, S2O3^2-, SCN^-, SO4^2-, Zn²⁺, 单线态氧, 羟基自由基, GSH, Hcy , Cys。由图2可以发现，其他离子或分子的加入荧光强度几乎没有影响，而探针能够根据波长的变化对SO2、Cys、GSH进行很好的区分。

实施例3 不同浓度的SO2下Co-SO2的荧光强度与波长变化

配制10 mL浓度为100 mM SO2的母液，并用水稀释为0-40 μM共17个等差浓度，以水为对照。将实施例2中Co-SO2母液稀释为5 μM，分别加入不同浓度的SO2，反应5s后进行荧光检测（λex = 460 nm, λem = 575 nm），检测各体系中荧光强度，以荧光强度-SO2浓度作曲线，如图3所示。由图可知，随着SO2浓度的增加，反应体系不但荧光强度增强，发射波长也发生红移，当SO2浓度达到25 μM时，反应体系荧光强度在575 nm达到饱和状态。

实施例4 Co-SO2荧光探针对SO2细胞成像

将本发明荧光探针Co-SO2应用于HeLa细胞中进行荧光成像，得图4，具体操作步骤如下：

（1）将4份密度为3×10⁵个/mL的HeLa细胞在温度为37 ℃，CO2浓度为5 %的培养箱中培养至细胞贴壁；

（2）取一份细胞，加5 μM Co-SO2孵育40 min，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，制样后在荧光显微镜下分别明场、DAPI通道、FITC通道、TRITC通道成像，激发波长为460 nm；

（3）取另一份细胞，加5 μM Co-SO2孵育40 min，加入SO2孵育1 min后，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，制样后在荧光显微镜下分别明场、DAPI通道、FITC通道、TRITC通道成像，激发波长为460 nm；

（4）取另一份细胞，操作同（3），不同在于将SO2换为Cys，激发波长为360 nm；

（5）取另一份细胞，操作同（3），不同在于将SO2换为GSH，激发波长为460 nm。

由图4可知，荧光探针Co-SO2可以与细胞内GSH、SO2、Cys反应，SO2、GSH与Co-SO2反应后在TRITC能够检测到信号，Cys与Co-SO2反应后在DAPI通道能够检测到信号，单独荧光探针Co-SO2仅在FITC检测到信号，说明GSH或SO2与Co-SO2反应后能使发射波段发生明显的红移，Cys与探针反应后发射波段发生蓝移。