本发明涉及一种多取代吡咯烷衍生物及其作为rho激酶抑制剂在癌症中的应用。
背景技术：
：rho激酶(rho-associatedkinases,rock)是参与细胞有丝分裂粘附、细胞骨架调整、肌肉细胞收缩、肿瘤细胞浸润等一系列细胞生命现象的重要酶。包括rocki和rockii，前者主要存在于非神经组织如心脏、肺、骨胳肌等细胞，后者主要存在于中枢神经系统，如海马锥体神经元、大脑皮质、小脑浦肯野细胞等。大量研究表明，rho/rock信号通路参与了多种癌症疾病，比如乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌、脑癌、头颈部癌、睾丸癌和膀胱癌。rock的异常表达会引起几种类型癌细胞的入侵和转移，在体内外模型中发现，由rock抑制剂引起的rho/rock通路抑制可以有效地抑制肿瘤生长。k.itoh等发现y27632可以抑制肌动球蛋白的rho介导的激活，也可以抑制mm1肝癌细胞的入侵活动，此外，连续给予y27632可以减少植入到同基因小鼠腹腔内的mm1细胞的散播。s.liu等观察到在转移性人类乳腺瘤和乳腺肿瘤细胞中，rock被超高表达，有趣的是，rock的超表达赋予局部性mcf-7乳腺癌细胞一种转移性表现。此外，由y27632引起的rock抑制或以rock为靶向的体外细胞迁移和扩散，也可以在体内阻止细胞迁移到人类的骨骼中。rki1447是2012年发现的一种选择性的rock抑制剂，在转基因鼠模型中，rki1447表现出十分重要的抗乳腺癌的反侵略性和抗肿瘤活性。这些实验证明了rock抑制剂在预防肿瘤侵袭、迁移和增殖方面的治疗潜能。目前使用的rock抑制剂大概分成以下几类：异喹啉类、苯并吡唑类、尿素类、氨基嘧啶类。新型rock抑制剂的研发进展缓慢，新型rock抑制剂的研发具有重要意义。技术实现要素：本发明提供的化合物为在已有的抑制剂信息和rock的空间结构信息的基础上设计的一类新型结构类型的化合物。rock精细结构为a、f和d区共同形成与atp结合的口袋结构。具体为如式ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐、酯、立体异构体、溶剂化合物，其中：r1、r2、r3、r4各自独立的选自-h、-f或-och3。本发明还提供了所述的如式ⅰ所示的化合物的合成方法，1)在合适的溶剂中，向1,1,1-三氟-5-甲基己烷-2,4-二酮和(e)-(2-硝基丙-1-烯-1-基)苯的溶液中加入dbu后反应得到1,1,1-三氟-6-甲基-4-(2-硝基-1-苯基丙基)庚烷-3,5-二酮(中间体1)；2)以乙醇为溶剂，raney镍为催化剂在合适的压力下将中间体1进行氢化，经后续处理后得到2-甲基-1-(2-甲基-3-苯基-5-(三氟甲基)-3,4-二氢-2h-吡咯-4-基)丙-1-酮(中间体2)；3)以thf和乙醇的混合溶液为溶剂，向中间体2中，加入氰基硼氢化钠和溴甲酚绿。反应结束后经硅胶色谱纯化得到中间体3；4)中间体3和相应的溴取代化合物在dipea和乙腈的混合物在50℃下加热1小时，经后续处理后可以得到对应的吡咯烷衍生物。进一步地，所述步骤1)中的溶剂可以为2-丙醇，二氯甲烷，dcm，thf等，优选thf和2-丙醇的溶液。进一步地，所述步骤2)中的压力范围为2-10atm，优选4atm。进一步地，所述步骤3)硅胶色谱中的洗脱剂用的是etoac-己烷，比例范围可以是65％:35％～95％:5％，优选85％etoac-15％己烷。本发明还提供了所述的如式ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐作为rho激酶抑制剂的应用。本发明还提供了所述的如式ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐在治疗癌症药物中的应用。进一步地，所述的癌症选自肝癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌。本发明还提供了一种药物组合物，包含如式ⅰ所示的化合物和/或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体。本发明的化合物可与药学上各种常用添加剂(如稀释剂和赋形剂等)制成药物组合物。根据治疗目的，可将药物组合物制成各种类型的给药单位剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体、悬浮液、乳液、颗粒剂、胶囊、栓剂和针剂(溶液及悬浮液)等。为了使片剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋形剂。例如，载体，如乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素和硅酸等；粘合剂，如水、乙醇、丙醇、普通糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明教溶液，羧甲基纤维素、紫胶、甲基纤维素和磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干淀粉、藻酸钠、琼脂粉和海带粉，碳酸氢钠、碳酸钙、聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘酯、淀粉和乳糖等；崩解抑制剂，如白糖、甘油三硬脂酸酯、椰子油和氢化油；吸附促进剂，如季胺碱和十二烷基硫酸钠等；润湿剂，如甘油、淀粉等；吸附剂，如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土和胶体硅酸等；以及润滑剂，如纯净的滑石，硬脂酸盐、硼酸粉和聚乙二醇等。如果需要的话，还可以用通常的涂渍材料使片剂作为糖衣片剂、涂明胶膜片剂、肠衣片剂、涂膜片剂、双层膜片剂及多层片剂。为了使丸剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋性剂，例如，载体，如乳糖，淀粉，椰子油，硬化植物油，高岭土和滑石等；粘合剂，如阿拉伯树胶粉，黄著胶粉，明胶和乙醇等；崩解剂，如琼脂和海带粉等。为了使栓剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知并广泛使用的赋性剂，例如，聚乙二醇，椰子油，高级醇，高级醇的酯，明胶和半合成的甘油酯等。为了制备针剂形式的药物组合物，可将溶液和悬浮液消毒，并最好加入适量的氯化钠，葡萄糖或甘油等，制成与血液等渗压的针剂。在制备针剂时，也可使用本领域内任何常用的载体。例如，水，乙醇，丙二醇，乙氧基化的异硬脂醇，聚氧基化的异硬脂醇和聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯等。此外，还可加入通常的溶解剂、缓冲剂和止痛剂等。根据需要，在治疗精神分裂症期间，也可加入着色剂、防腐剂、香料、调味剂、香化剂和其它药物等。本发明中，所述的药物组合物的给药方法没有特殊限制。可根据病人年龄、性别和其它条件及症状，选择各种剂型的制剂给药。例如，片剂、丸剂、溶液、悬浮液、乳液、颗粒剂和胶囊是口服给药；针剂可以单独给药，或者和注射用输送液(如葡萄糖溶液及氨基酸溶液)混合进行静脉注射，如有必要可以单纯用针剂进行肌肉、皮内、皮下或腹内注射；栓剂为给药到直肠。本发明中，可以根据服药方法、病人年龄、性别和其它条件以及症状适当地选择用药剂量。具体实施方式中间体1：1,1,1-三氟-6-甲基-4-(2-硝基-1-苯基丙基)庚烷-3,5-二酮的合成：将1,1,1-三氟-5-甲基己烷-2,4-二酮(35.0g，0.192mol)和(e)-(2-硝基丙-1-烯-1-基)苯(37.9g，0.232mol)溶于210ml的thf和35ml的2-丙醇溶液中。加入1g1,8-二氮杂双环[5.4.0]-十一碳-7-烯(dbu)，然后将反应混合物在室温下搅拌2小时，在搅拌期间，隔20分钟后再加入0.65g的dbu，1小时后再加入0.25g的dbu。2小时后，tlc(95％ch2cl2-5％etoac)显示大部分起始原料消失。将溶剂在真空中浓缩并加入500ml甲苯。有机相用稀盐酸洗涤，然后再用nacl溶液洗涤。用na2so4干燥后，浓缩溶液，残余物经硅胶层析，用3:1己烷-etoac洗脱，得到异构体混合物3，1,1,1-三氟-6-甲基-4-(2-硝基-1-苯基丙基)庚烷-3,5-二酮，产量是53.82g，产率为78％。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:1.03(s,3h),1.05(s,3h),1.79(d,3h),2.39(m,1h),3.16(m,1h),3.46(dd,1h),3.97(d,1h),5.74(m,1h),7.21(t,1h),7.28(m,4h).13c-nmr(125mhz,cdcl3)δ:17.41,18.56,38.70,42.88,48.41,64.03,80.87,123.34,126.16,128.14,130.12,140.22,176.69,204.04.lc-ms(esi,pos,ion)m/z:360[m+h].中间体2：2-甲基-1-(2-甲基-3-苯基-5-(三氟甲基)-3,4-二氢-2h-吡咯-4-基)丙-1-酮的合成：将溶解在500ml乙醇中的中间体1(41.00g，0.114mol)在4atm压力下用81.00graney镍(在使用前用乙醇洗涤三次)氢化。过滤催化剂后，浓缩溶液，残余物经硅胶层析，用溶解在ch2cl2中的8.5％etoac的溶液洗脱，得到2-甲基-1-(2-甲基-3-苯基-5-(三氟甲基)-3,4-二氢-2h-吡咯-4-基)丙-1-酮(中间体2)，32.23g，产率95％。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:1.03(s,3h),1.05(s,3h),1.14(d,3h),2.19-2.34(m,2h),3.71(d,1h),4.28(m,1h),7.21(t,1h),7.28(m,4h).13c-nmr(125mhz,cdcl3)δ:18.56,20.06,38.70,54.46,58.81,75.60,124.23,124.79,128.52,129.68,141.16,160.67,208.88.lc-ms(esi,pos,ion)m/z:298[m+h].中间体3：2-甲基-1-((2r,3r,4s)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)丙-1-酮的合成：将中间体2(21.89g，0.074mol)溶于27mlthf和54ml乙醇中。加入氰基硼氢化钠(23.50g，0.374mol)和5mg溴甲酚绿。向该蓝色溶液中滴加浓hcl的乙醇溶液(1:2)，以使溶液颜色始终保持浅黄绿色的速率滴加。在不滴加hcl时，溶液颜色持续保持黄色，然后将该溶液再搅拌20分钟。将溶液真空浓缩，然后用chcl3萃取，用khco3溶液洗涤。将有机相分离，用na2so4干燥并浓缩。将残余物在硅胶上进行色谱分离，用85％etoac-15％己烷洗脱，得到13.75g2-甲基-1-((2r,3r,4s)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)丙-1-酮(中间体3)和7.75g2-甲基-1-((2r,4r)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)丙-1-酮(中间体3”)的混合物。用纯乙酸乙酯进一步洗脱，得到4.18g纯的2-甲基-1-((2r,3s,4s)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)丙-1-酮(中间体3’)。将上述纯的中间体3’(4.18g)溶于10ml乙醇中，加入20滴乙醇钠的乙醇溶液。将该溶液回流过夜。tlc(etoac)显示无起始物质。用乙醇中的hcl中和过量的naoet，并将溶液真空浓缩。将残余物溶于甲苯中并用khco3溶液洗涤。将甲苯溶液用na2so4干燥并浓缩，得到3.89g经tlc(etoac)纯化的中间体3。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:1.03(s,3h),1.05(s,3h),1.06(d,3h),1.51(s,1h),2.34(m,1h),2.44(m,1h),3.43(t,1h),3.63(m,1h),4.10(m,1h),7.21(t,1h),7.28(m,4h).13c-nmr(125mhz,cdcl3)δ:17.94,18.56,38.52,54.97,58.49,64.08,71.00,124.96,128.50,129.49,129.79,141.06,217.91.lc-ms(esi,pos,ion)m/z:300[m+h].实施例1：1-((2s,3r,4s)-1-(4-丁基苯基)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)-2-甲基丙基-1-酮的合成：将中间体3、中间体3”(共25.39g，0.085mol)，4-丁基溴苯(0.086mol)，n,n-二异丙基乙胺(dipea)(18.30g，0.142mol)和乙腈(55ml)的混合物在50℃下加热1小时。tlc(etoac)显示没有起始原料。加入甲苯，混合物用khco3溶液洗涤，然后用na2so4干燥，浓缩。再加入甲苯，再次在真空中浓缩。重复该操作直至n,n-二异丙基乙胺(dipea)的气味消失，得到最终产物1-((2s,3r,4s)-1-(4-丁基苯基)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)-2-甲基丙基-1-酮，产量30.81g，产率为84％。1h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:0.89(t,3h),1.04(d,6h),1.19-1.33(m,5h),1.56(m,2h),2.23-2.36(m,2h),2.55(t,2h),3.13(t,1h),4.24(m,1h),4.45(m,1h),6.68(dt,2h),6.89(dt,2h),7.21-7.28(m,5h).13c-nmr(125mhz,cdcl3)δ:14.00,16.42,18.56,21.71,31.87,35.81,38.52,53.65,59.02,63.1,64.07,116.68,125.38,127.18,128.58,128.87,130.23,130.52,140.84,146.25,218.3.lc-ms(esi,pos,ion)m/z:432[m+h].实施例2：：1-((2s,3r,4s)-1-(2-氟-4-丁基苯基)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)-2-甲基丙基-1-酮的合成将中间体3、中间体3”(共25.39g，0.085mol)，2-氟-4-丁基溴苯(0.086mol)，n,n-二异丙基乙胺(dipea)(18.30g，0.142mol)和乙腈(55ml)的混合物在50℃下加热1小时。tlc(etoac)显示没有起始原料。加入甲苯，混合物用khco3溶液洗涤，然后用na2so4干燥，浓缩。再加入甲苯，再次在真空中浓缩。重复该操作直至n,n-二异丙基乙胺(dipea)的气味消失，得到最终产物1-((2s,3r,4s)-1-(4-丁基苯基)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)-2-甲基丙基-1-酮，产量30.95g，产率为81％。lc-ms(esi,pos,ion)m/z:450[m+h].实施例:3：1-((2s,3r,4s)-1-(2-甲氧基-4-丁基苯基)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)-2-甲基丙基-1-酮的合成将中间体3、中间体3”(共25.39g，0.085mol)，2-甲氧基-4-丁基溴苯(0.086mol)，n,n-二异丙基乙胺(dipea)(18.30g，0.142mol)和乙腈(55ml)的混合物在50℃下加热1小时。tlc(etoac)显示没有起始原料。加入甲苯，混合物用khco3溶液洗涤，然后用na2so4干燥，浓缩。再加入甲苯，再次在真空中浓缩。重复该操作直至n,n-二异丙基乙胺(dipea)的气味消失，得到最终产物1-((2s,3r,4s)-1-(2-甲氧基-4-丁基苯基)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)-2-甲基丙基-1-酮，产量30.21g，产率为77％。lc-ms(esi,pos,ion)m/z:462[m+h].实施例4：1-((2s,3r,4s)-1-(2,6-二氟-4-丁基苯基)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)-2-甲基丙基-1-酮的合成将中间体3、中间体3”(共25.39g，0.085mol)，2,6-二氟-4-丁基溴苯(0.086mol)，n,n-二异丙基乙胺(dipea)(18.30g，0.142mol)和乙腈(55ml)的混合物在50℃下加热1小时。tlc(etoac)显示没有起始原料。加入甲苯，混合物用khco3溶液洗涤，然后用na2so4干燥，浓缩。再加入甲苯，再次在真空中浓缩。重复该操作直至n,n-二异丙基乙胺(dipea)的气味消失，得到最终产物1-((2s,3r,4s)-1-(2,6-二氟-4-丁基苯基)-5-甲基-4-苯基-2-(三氟甲基)吡咯烷-3-基)-2-甲基丙基-1-酮，产量31.39g，产率为79％。lc-ms(esi,pos,ion)m/z:468[m+h].实施例5～实施例9：试验例1：rocki的酶抑制活性实验一、实验原理：rocki抑制活性的测量采用了invitrogen公司的z′-lytetm技术，该技术基于荧光共振能量转移(fret)原理，以磷酸化和非磷酸化多肽对蛋白水解切割的敏感性差异为基础。二、实验方法：1、试剂的准备激酶缓冲液：将2ml的5x激酶缓冲液用水稀释到10ml；化合物：将所要测试的化合物用水稀释到一个浓度梯度；rock激酶/底物的混合溶液：配制2250μlrock/底物的混合溶液；酶的浓度为10ng/ml，底物的浓度为4μm，溶剂为激酶缓冲液；磷酸化多肽溶液：将2μl的丝氨酸/苏氨酸磷酸化7肽加到498μl的激酶缓冲液中，充分混匀；atp溶液：配制1110μl的atp溶液，浓度为50μm，溶剂为激酶缓冲液；显色剂：按1:32768的比例稀释显色剂a。2、实验步骤(1)将2.5μl配制好的化合物溶液加到黑色384孔板；(2)加入5μlrock激酶/底物的混合溶液；(3)加入2.5μl的atp溶液；(4)将384孔板在室温下震荡并培养1小时；(5)将5μl显色剂加入到孔板中，继续反应1小时；(6)将孔板置于酶标仪中读数。三、实验结果：使用不同浓度的本发明化合物进行rocki的抑制活性实验，发现本发明化合物具有很好的抑制活性，其半抑制浓度ic50如下表所示：实施例ic50(μm)实施例10.32实施例20.27实施例30.20实施例40.24试验例2：癌细胞体外抑制实验一、实验原理mtt分析法以活细胞代谢物还原剂mtt噻唑蓝为基础，利用酶标仪测定490nm处的光密度od值，以反映出活细胞数目，从而测定化合物对肿瘤细胞的杀伤效果。二、实验步骤(1)取对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化，rpmi1640细胞培养液调细胞悬液浓度为6×104个/ml。在96孔培养板中每孔加细胞悬液100μl，置37℃，5％co2培养箱中培养24h，细胞贴壁。(2)移走rpmi1640细胞培养液，加入浓度梯度的待测药物的rpmi1640细胞培养液100μl，每个浓度设6个平行孔。将加药后的96孔板置于37℃，5％co2培养箱中培养48h，倒置显微镜下观察药物的作用效果。(3)96孔板离心后弃去培养液，小心用pbs冲2～3遍后，再加入含0.5％mtt的rpmi1640细胞培养液100μl，继续培养4h。(4)移走上清，每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使formazan结晶充分溶解。(5)在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的光密度(od值)。(6)平行孔od值以mean±sd表示，计算抑制率公式：[(od对照组-od空白组)-(od药物实验组-od空白组)]/(od对照组-od空白组)*100％。对照组(加入浓度梯度的待测药物改为加入不含药物的rpmi1640细胞培养液)；空白组(与对照组相比，不加细胞)。(7)采用graphpadprism5数据处理软件，通过绘制量效曲线计算半数抑制浓度(ic50)。三、实验结果在肝癌细胞、卵巢癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞株、乳腺癌细胞株、膀胱细胞株等上的研究中均发现rock的过高表达，本实验采用多种癌细胞来证实本发明化合物抗癌细胞活性，使用的4种癌细胞为人肺癌细胞a549，人肝癌细胞smmc-7721，人大细胞肺癌细胞nci-h460，人乳腺癌细胞mcf-7。下表中所列实施例化合物对四种癌细胞的ic50均＜10μm，对部分癌细胞的ic50均＜5μm。综上所述，本发明所述的如式ⅰ所示的化合物具有rocki的抑制活性，具有多种癌细胞的抑制活性，有机会成为治疗癌症的化学药物注册分类中的一类新药。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。当前第1页12