一种可进行多重核酸扩增的反应管的制作方法

本发明涉及生物科学研究与医学检验等应用技术领域，具体而言，涉及一种可进行多重核酸扩增的反应管。

背景技术：

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)技术，是一种体外快速扩增dna的技术，每个循环包括变性、退火和延伸三个过程。首先，在大约95℃的高温下加热双链dna样品，双链间的氢键会断裂，使得dna热分解成两条互补的单链dna分子，这一过程称为高温解链反应；然后，温度迅速降到大约50-65℃的范围内，在这个温度下单链dna与引物按碱基互补配对原则结合，这一过程称为低温退火反应；退火反应结束后，温度要迅速升高到72℃左右进行延伸反应，在dna聚合酶以及适当镁离子浓度的条件下，从引物的3’端开始结合单核苷酸，从而形成一条新的dna。经过一个这样的过程，原来的一个dna双链分子就形成了两个dna分子，数量增加了一倍。每经过一个循环，目的核酸分子的数目扩增一倍，并且这些新形成的双链又可以作为下次循环的模板，经过30-40个循环，目的核酸分子数目扩增到原来的近10⁹倍。

所以，pcr又被称为无细胞分子克隆或特异性dna序列体外引物定向酶促扩增技术，使目标dna得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时高效等特点，它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断等任何含有dna、rna的地方。

另外，恒温扩增也属于核酸扩增的新方法，近年来越来越受到广泛关注。

不管是pcr扩增技术还是恒温扩增技术，在对多重核酸同时扩增反应时，由于反应装置的设计缺陷，难免存在反应环境条件和操作时间上的不一致，出现先后反应的扩增效果差别较大的情况。而传统pcr管进行多重pcr时扩增体系易出现交叉干扰，影响扩增效果。

所以，如何改进核酸扩增反应管的结构设计，适用于多重核酸同时反应、提高dna扩增效率、减少时间和热量的耗费是本领域技术人员亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可进行多重核酸扩增的反应管，以解决现有技术中的核酸扩增反应管存在的对多重核酸扩增时操作不集中统一、反应条件不一致、交叉干扰且扩增效率低下等问题。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供的一种可进行多重核酸扩增的反应管，包括基座和多个反应管腔；所述基座设置一个基准平面，多个所述反应管腔的开口均设置于所述基准平面，其内腔均垂直于所述基准平面向所述基座内部延伸。

在上述技术方案的基础上，进一步，多个所述反应管腔绕同一轴线呈环状分布。

——该技术方案的技术效果在于：环状分布的多个反应管腔一方面结构比较紧凑，另一方面布局更加规整，方便了检测试验中注入和提取检验样本的操作。例如，八个、十二个或者十六个反应管腔绕同一中心轴呈环状分布。

在上述任一技术方案的基础上，进一步，多个所述反应管腔沿多个不同半径的环状分布。

——该技术方案的技术效果在于：该结构可将多个反应管腔分多个不同半径但同轴的环状分布，在较小的空间内设置尽可能多个反应管腔。例如，外圈设置十二个反应管腔，内圈设置六个反应管腔，绕相同的中心轴均匀布置。

在上述任一技术方案的基础上，进一步，位于同一环形的多个所述反应管腔各自单独固定于所述基座。

——该技术方案的技术效果在于：独立设置的各个反应管腔节省了整个反应管的材料，减轻了反应管的重量。同时，由于多个反应管腔独立设置，在外形上容易区分和编排，方便了试验的操作，提高了检测效率。

或者，位于同一环形的多个所述反应管腔一体成型固定于所述基座。

——该技术方案的技术效果在于：将全部反应管腔一体成型设置在基座上，利于对所有反应管腔统一加热实现恒温的效果，并且整个反应管结构更紧凑，外形更完整。

在上述任一技术方案的基础上，进一步，还包括中心管腔；所述中心管腔设置于所述基准平面，位于多个所述反应管腔的环状中心。

——该技术方案的技术效果在于：中心管腔不仅能够降低反应管体的重量，并能够利用中心管腔作为操作空间，通过与中心管腔配合的操作手柄，进行扩增反应操作。

在上述任一技术方案的基础上，进一步，所述中心管腔贯穿所述基座。

——该技术方案的技术效果在于：贯穿基座的中心管腔进一步降低了反应管的质量，也为试验操作提供了足够的空间。

在上述任一技术方案的基础上，进一步，所述基座呈圆柱状，其轴线与所述中心管腔的轴线重合。

——该技术方案的技术效果在于：圆柱状的基座方便设置旋盖，利用与其侧壁的螺纹配合的结构，实现旋盖对所有反应管腔的统一封堵。

在上述任一技术方案的基础上，进一步，还包括封堵件或者旋盖；所述封堵件设置在任一所述反应管腔的开口；所述旋盖螺旋设置在所述基座的一端，封堵多个所述反应管腔的开口。

——该技术方案的技术效果在于：封堵件设置在封堵反应管腔的开口，优选采用热封膜或者热封胶实现密封，旋盖对所有反应管腔实现整体封堵，暂时封存反应管腔内的核酸样本溶液，防止受到外界灰尘、光照等因素的影响，也可防止核酸样本溶液倾倒流出。另外，为了方便注入核酸样本溶液，可在旋盖上设置注入孔。

在上述任一技术方案的基础上，进一步，多个所述反应管腔在所述基准平面上呈行列式分布。

——该技术方案的技术效果在于：呈行列式分布的反应管腔结构更为规整，定位更加准确。此时，可采用热封膜或者热封胶密封反应管腔。

本发明具有如下有益效果：

本发明提供的可进行多重核酸扩增的反应管，在基座的基准平面上设置多个反应管腔，可加入核酸样本及多种pcr体系进行多重pcr扩增，或者管腔内含pcr冻干体系，根据需要将一种核酸样本分配到不同的反应管腔中实现扩增，也可以同时对多种不同的核酸进行扩增，并于同样的反应环境中保存或者进行其他反应试验，大大提高了核酸扩增效率，并保证了核酸扩增的条件统一性。

本发明的附加技术特征及其优点将在下面的描述内容中阐述地更加明显，或通过本发明的具体实践可以了解到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的第一种可进行多重核酸扩增的反应管的外形立体结构图；

图2为图1中的主视图；

图3为图2中的俯视图；

图4为本发明实施例提供的第二种可进行多重核酸扩增的反应管的外形立体结构图；

图5为图4中的主视图；

图6为图5中的俯视图；

图7为本发明实施例提供的第三种可进行多重核酸扩增的反应管的外形立体结构图；

图8为图7中的俯视图；

图9为本发明实施例提供的第四种可进行多重核酸扩增的反应管的外形立体结构图；

图10为图9中的主视图；

图11为图10中的俯视图；

图12为集成与多重管式pcr扩增琼脂糖凝胶电泳结果图；

图13为集成pcr扩增琼脂糖凝胶电泳结果图。

图标：1-基座；2-基准平面；3-反应管腔；4-中心管腔。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

一、现有技术说明：

不管是pcr扩增技术还是恒温扩增技术，在对多重核酸同时扩增反应时，由于反应装置的设计缺陷，难免存在反应环境条件和操作时间上的不一致，出现先后反应的扩增效果差别较大的情况。而传统pcr管进行多重pcr时扩增体系易出现交叉干扰，影响扩增效果。

二、本发明技术方案概述：

本发明提供的可进行多重核酸扩增的反应管，包括基座1和多个反应管腔3；基座1设置一个基准平面2，多个反应管腔3的开口均设置于基准平面2，其内腔均垂直于基准平面2向基座1内部延伸。

上述可进行多重核酸扩增的反应管的技术方案，能够较好地解决现有技术中的核酸扩增反应管存在的对多重核酸扩增时操作不集中统一、反应条件不一致、交叉干扰且扩增效率低下等问题：在基座1的基准平面2上设置多个反应管腔3，可加入核酸样本及多种pcr体系进行多重pcr扩增，或者管腔内含pcr冻干体系，根据需要将一种核酸样本分配到不同的反应管腔3中实现扩增，也可以同时对多种不同的核酸进行扩增，并于同样的反应环境中保存或者进行其他反应试验，大大提高了核酸扩增效率，并保证了核酸扩增的条件统一性。

三、本发明技术方案具体实施方式：

针对上述现有技术方案存在的技术问题，下面结合具体的实施方式对本发明的技术方案做进一步的解释说明：

本实施例提供了一种可进行多重核酸扩增的反应管，其中：图1为本发明实施例提供的第一种可进行多重核酸扩增的反应管的外形立体结构图；图2为图1中的主视图；图3为图2中的俯视图；图4为本发明实施例提供的第二种可进行多重核酸扩增的反应管的外形立体结构图；图5为图4中的主视图；图6为图5中的俯视图。如图1～6所示，可进行多重核酸扩增的反应管包括基座1和多个反应管腔3；基座1设置一个基准平面2，多个反应管腔3的开口均设置于基准平面2，其内腔均垂直于基准平面2向基座1内部延伸。

在上述实施例的基础上，进一步地，如图1、3、4、6所示，多个反应管腔3绕同一轴线呈环状分布。此时，环状分布的多个反应管腔3一方面结构比较紧凑，另一方面布局更加规整，方便了检测试验中注入和提取检验样本的操作。例如，八个、十二个或者十六个反应管腔3绕同一中心轴呈环状分布。

图7为本发明实施例提供的第三种可进行多重核酸扩增的反应管的外形立体结构图；图8为图7中的俯视图。在上述实施例的基础上，如图7、8所示，进一步地，多个反应管腔3沿多个不同半径的环状分布。该结构的反应管，将多个反应管腔3分多个不同半径但同轴的环状分布，在较小的空间内设置尽可能多个反应管腔3。例如，外圈设置十二个反应管腔3，内圈设置六个反应管腔3，绕相同的中心轴均匀布置。

在上述实施例的基础上，如图1、2所示，进一步地，位于同一环形的多个反应管腔3各自单独固定于基座1。在该结构中，独立设置的各个反应管腔3节省了整个反应管的材料，减轻了反应管的重量。同时，由于多个反应管腔3独立设置，在外形上容易区分和编排，方便了试验的操作，提高了检测效率。

或者，如图4、5、7所示，位于同一环形的多个反应管腔3一体成型固定于基座1。此时，将全部反应管腔3一体成型设置在基座1上，利于对所有反应管腔3统一加热实现恒温的效果，并且整个反应管结构更紧凑，外形更完整。

在上述实施例的基础上，如图1、3、4、6、7、8所示，进一步地，还包括中心管腔4；中心管腔4设置于基准平面2，位于多个反应管腔3的环状中心。在该结构中，中心管腔4不仅能够降低反应管体的重量，并能够利用中心管腔4作为操作空间，通过与中心管腔4配合的操作手柄，进行扩增反应操作。

在上述实施例的基础上，如图1、3、7、8所示，进一步地，中心管腔4贯穿基座1，进一步降低了反应管的质量，也为试验操作提供了足够的空间。

在上述实施例的基础上，如图1～8所示，进一步地，基座1呈圆柱状，其轴线与中心管腔4的轴线重合。在该结构中，圆柱状的基座1方便设置旋盖，利用与其侧壁的螺纹配合的结构，实现旋盖对所有反应管腔3的统一封堵。

在上述实施例的基础上，进一步地，还包括封堵件(未标注)或者旋盖(未标注)。其中，封堵件设置在任一反应管腔3的开口，旋盖螺旋设置在基座1的一端，封堵多个反应管腔3的开口。此时，封堵件优选采用热封膜或者热封胶实现任一单个反应管腔3的密封，旋盖对所有反应管腔3实现整体封堵，暂时封存反应管腔3内的核酸样本溶液，防止受到外界灰尘、光照等因素的影响，也可防止核酸样本溶液倾倒流出。另外，为了方便注入核酸样本溶液，可在旋盖上设置注入孔。

图9为本发明实施例提供的第四种可进行多重核酸扩增的反应管的外形立体结构图；图10为图9中的主视图；图11为图10中的俯视图。在上述实施例的基础上，如图9～11所示，进一步地，多个反应管腔3在基准平面2上呈行列式分布。呈行列式分布的反应管腔3结构更为规整，定位更加准确。此时，可采用热封膜或者热封胶密封反应管腔3。

下面，通过多重管式pcr扩增试验进行说明：

图12为集成与多重管式pcr扩增琼脂糖凝胶电泳结果图。如图12所示，其中，

m：①dna2000，50ng；②dna1000，50ng；③dna750，150ng；④dna500，50ng；⑤dna250，50ng；⑥dna100，50ng；

1：四个孔的阴性对照；

2：集成pcr管式扩增西尼罗河病毒电泳结果图；

3：集成pcr管式扩增东方马脑炎病毒电泳结果图；

4：集成pcr管式扩增委内瑞拉马脑炎病毒电泳结果图；

5：集成pcr管式扩增森林脑炎病毒电泳结果图；

6：8联排管式双重扩增西尼罗河病毒、东马脑炎病毒电泳结果图(条带从上至下)；

7：8联排管式双重扩增西尼罗河病毒、委内瑞拉马脑炎病毒电泳结果图(条带从上至下)；

8：8联排管式双重扩增西尼罗河病毒、森林脑炎病毒电泳结果图(条带从上至下)；

9：8联排管式双重扩增东方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒电泳结果图(条带从上至下)；

10：8联排管式双重扩增东方马脑炎病毒、森林脑炎病毒电泳结果图(条带从上至下)；

11：8联排管式双重扩增委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒电泳结果图(条带从上至下)；

12：8联排管式3重扩增西尼罗河病毒、东方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒电泳结果图(条带从上至下)；

13：8联排管式3重扩增西尼罗河病毒、东方马脑炎病毒、森林脑炎病毒电泳结果图(条带从上至下)；

14：8联排管式3重扩增西尼罗河病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒电泳结果图(条带从上至下)；

15：8联排管式3重扩增东方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒电泳结果图(条带从上至下)；

16：8联排管式4重扩增西尼罗河病毒、东方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒及森林脑炎病毒电泳结果图(条带从上至下)。

图13为集成pcr扩增琼脂糖凝胶电泳结果图。如图13所示，其中，m：①dna2000，50ng；②dna1000，50ng；③dna750，150ng；④dna500，50ng；⑤dna250，50ng；⑥dna100，50ng；

2-8：集成管式自动加样pcr扩增森林脑炎病毒电泳结果图；

9-16：集成管式手动加样pcr扩增森林脑炎病毒电泳结果图；

1、9：阴性对照

实施例1、四种蚊媒类病毒集成管式pcr扩增定性、半定量检测1、四种蚊媒类病毒特异性引物设计

选取蚊媒类病毒：西尼罗河病毒、东方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒及森林脑炎病毒，以它们的基因编码区为扩增靶区域，设计特异性引物，序列见表1.四种蚊媒类病毒特异性引物序列。

表1.四种蚊媒类病毒特异性引物序列

2、pcr体系配制

(1)配制4重pcr反应体系，包括：pcr反应总反应体积为50μl，5×pcr缓冲液10μl，25×酶2μl，西尼罗河病毒、东方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒及森林脑炎病毒上、下游引物各0.3μmol/l，模板6μl，补水至终体积50μl；

(2)配制3重pcr反应体系，共4组分别为：①西尼罗河病毒、东方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒组；②西尼罗河病毒、东方马脑炎病毒、森林脑炎病毒组；③西尼罗河病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒组；④东方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒及森林脑炎病毒组。包括：pcr反应总反应体积为25μl，5×pcr缓冲液5μl，25×酶1μl，上、下游引物各0.3μmol/l，模板6μl，补水至终体积25μl。

(3)配制2重pcr反应体系，共6组分别为：①西尼罗河病毒、东方马脑炎病毒组；②西尼罗河病毒、委内瑞拉马脑炎病毒组；③西尼罗河病毒、森林脑炎病毒组；④东方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒组；⑤东方马脑炎病毒、森林脑炎病毒组；⑥委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒组；包括：pcr反应总反应体积为25μl，5×pcr缓冲液5μl，25×酶1μl，上、下游引物各0.3μmol/l，模板6μl，补水至终体积25μl。

(4)配制单重pcr反应体系，共4组分别为：①西尼罗河病毒；②东方马脑炎病毒；③委内瑞拉马脑炎病毒；④森林脑炎病毒组；包括：pcr反应总反应体积为15μl，5×pcr缓冲液3μl，25×酶0.6μl，上、下游引物各0.3μmol/l，模板6μl，补水至终体积15μl。

3、pcr扩增

(1)96-wellthermalcyclerpcr仪扩增

将以上2、3、4重体系分别加入axgen8联排pcr管中，反应条件：50℃，2min；94℃，2min；94℃，15s，58℃，45s，共35个循环；(2)集成管式pcr仪扩增

将以上单重体系由管顶部分别加入8孔集成管中，1、3、5、7号孔中分别加入①西尼罗河病毒；②东方马脑炎病毒；③委内瑞拉马脑炎病毒；④森林脑炎病毒单重反应体系，2、4、6、8号小孔中加入阴性对照体系，反应条件：50℃，2min；94℃，2min；94℃，15s，58℃45s，共35个循环。

4、定性半定量检测结果

参考康为dm2000dnamarker用于琼脂糖凝胶电泳实验检测说明，使用gelimagesystemid分析软件，4种病毒集成管式扩增效果优于3、4重axgen8联排pcr管式反应。半定量结果如表2.不同扩增体系pcr扩增产物总量表所示，定性结果图12所示。

表2.不同扩增体系pcr扩增产物总量表

a:未检测到目的产物条带。

实施例2、集成管式pcr扩增稳定性定性、半定量检测

1、pcr体系配制

配制pcr反应体系，每孔pcr反应总反应体积为15μl，5×pcr缓冲液3μl，25×酶0.6μl，上、下游引物各0.3μmol/l，模板6μl，补水至终体积15μl。

2、pcr扩增

将以上配制体系由管顶部分别加入8孔集成管中，1号小孔中加入阴性对照体系，2-8号孔中加入森林脑炎病毒反应体系。

反应条件：50℃，2min；94℃，2min；94℃，15s，58℃45s，共35个循环。

3、定性半定量检测结果

参考康为dm2000dnamarker用于琼脂糖凝胶电泳实验检测说明，使用gelimagesystemid分析软件，结果表明：自动与手动加样，pcr扩增效果较稳定均一，自动加样与手动加样效果相当，且较均一稳定。半定量结果如表3.集成pcr扩增琼脂糖凝胶电泳结果图所示，定性结果图13所示。

表3.集成pcr扩增琼脂糖凝胶电泳结果图

a:未检测到目的产物条带。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

此外，本领域的技术人员能够理解，尽管上述的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。另外，公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。