一种启动子BgIosP520、其制备方法及用途的制作方法

专利名称:一种启动子BgIosP520、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及一种启动子，具体地，涉及一种来源于水稻的启动子。本发明还涉及含有该启动子的重组载体、含有该重组载体的重组细胞、转化有所述启动子的愈伤组织、一种制备转基因植物的方法、以及所述启动子的制备方法及用途。
背景技术：
启动子是基因的一个组成部分，通常位于结构基因5’端上游，是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。启动子能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合,活化RNA聚合酶，启动基因转录，从而控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。在转基因植物中，启动子是影响转基因表达效率的重要因素之一，选择高效率的启动子是高效率表达外源基因的关键。
根据启动子的转录模式可将其分为3类组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。所谓组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子。双子叶植物中最常使用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子。另一种高效的组成型启动子CsVMV是从木薯叶脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus)中分离的。
人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子。例如肌动蛋白(actin)和泛素 (ubiquitin)等基因的启动子已被克隆。用这些启动子代替CaMV 35S启动子，可以更有效地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶P亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，用其代替CaMV 35S启动子，在转基因烟草中也取得了很好的表达效果(Plantbiotechnology, 2002,19 (I) : 19-26)。
单子叶植物基因中常见的启动子有Ubi启动子(Plant ub i quit inpromo t er)、Actin 启动子(Plant Actin promoter)和 Adh-I 启动子(Maize alcohol dehydrogenase
Ipromoter)。
Ubi启动子以其启动效率高、甲基化程度低、遗传性状稳定等因素而倍受青睐。目前，已经从很多泛素基因中分离得到启动子序列，例如玉米基因组中的Ubi-I启动子、水稻泛素RUBQ2启动子、拟南芥泛素启动子、向日葵泛素UbBl启动子、烟草泛素Ubi. U4启动子、马铃薯泛素Ubi7启动子、番茄泛素Ubil-I启动子、大麦泛素Mubl启动子，等等。玉米泛素Ubi-I启动子已经广泛地应用于玉米、小麦、水稻等单子叶植物中，水稻泛素RUBQ2启动子在水稻和甘蔗中也有较多的应用。
Actin启动子1990年由康奈尔大学的McElroy等首次在水稻中发现,属于强组成型启动子。Actin启动子在单子叶禾本科中作用显著，但是邻近科属的植物中的基因调控功能却十分不理想。因此，许多相关研究通过其它单子叶植物寻找Actin启动子，并成功在香蕉、甜瓜、玉米和拟南芥中陆续发现。Actin启动子由于对基因表达的强调控作用，在单子叶植物优良性状的转基因中已经得到越来越广泛的应用。
Adh-I启动子调控乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)基因，对植物在缺氧环境下乙醇脱氢酶的表达至关重要。Adh-I启动子对单子叶植物特别是谷类植物如水稻、燕麦和大麦，和少部分双子叶植物如烟草，基因的调控功能比花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子提高10-50倍。Adh-I启动子主要应用于单子叶植物，对绝大部分双子叶植物基因表达的调控效果都很有限。
单子叶植物是被子植物的主要类群，单子叶植物中的禾本科、百合科、棕榈科和天南星等，是非常重要的农业作物。单子叶植物基因的强效启动子，能够调控植物高效率表达具有特殊性状的外源基因，对优良作物的分子育种研究意义重大。
在强效启动子相关研究领域，发现并验证了许多单子叶植物的启动子。此外，双子叶植物中的一些强效启动子如CsVMV启动子、番茄E8启动子、白藜芦醇合酶基因Vstl启动子等高效启动子，在单子叶植物中也有很强的基因调控作用。
尽管已经有上述已知的单子叶植物的启动子，本发明人通过对水稻基因组的深入研究，提供了一种新的来源于单子叶植物的启动子，所述启动子能够用于调控单子叶植物 甚至是双子叶植物中目的基因表达，为研究单子叶植物和双子叶植物中目的基因表达提供了一种新的工具和选择。

发明内容
本发明人经过大量的试验和创造性的劳动，从水稻日本晴(Oryzasativa L. ssp.japonica cv. Nipponbare)中得到了一种启动子,并且本发明人惊奇地发现,该启动子不仅能够调控单子叶植物(例如水稻)中目的基因的表达，而且能够调控双子叶植物(例如烟草)中目的基因的表达。由此提供了下述发明
本发明的一个方面提供了一种具有SEQ ID NO :1所不核苷酸序列的启动子。在本发明中，所述启动子的具体碱基序列长度为879个碱基，如SEQ ID NO :I所示
GTGTAGATAAGTGTTCCGCTGGAATTTTATGCAGGTGCTGTACCCTATGTGCTGCTTTTTTTTTGTGTGGGGCGCCCCCCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTGTTACCTGGATGATTGCAAATAAGAACCCCGGCAAATCTGCTGGTTGGTTGCAAATAATAACCCCTCCAAATCTGCGCAGATGAAACCCCATTCAGGACATGAATTACGATTGTTCATGAGCTATTTGGATCATGGAAAGATTGGAAACAAACTCTTACGTCAAGGTTTCTACTAATTACGTGATTCCGATTTCAGAGTCAGCCATGGCTATACTGCCTTTGCTCCAGTAAACATCGCTGCTCTAGTAACAAACATTGCAGTAAACATCACAACTATCCAATTCCCTTGTTGCTGCTCTAGTAAAAAACATTACAATTATCCAATTCCCAGATATTTTTTTTCACTGCTCCAAAACCTGAAGTACATATACGTGAGTTGAGTGATCCAGCAACATAAAAATCCGAGGCTCCGAGCGATCTGCACCAACCATCTCACCCGTCCGACGTGGCAGCAGCAACCAGCCACAGCTGAGACCTCCATCCAATAGAAACCCTCCCTTTGATTCCCCCGTATCCCGGCATCCGGATAACGCTGGATAAGAGGCGACGCCTCCCATTGGCCACACCCACCCAACAACGCATCCTGGCCGTCCGATCCACCCCCACCACCGATCTCCGCCGTCCGTCGCCGCCCTCGCCGCCGTGGACACCTGGCAGCGCCGGCCACTCCCGGACAGTTTAATACAAGCCACGCCTTTGCTCCGTGCCGGCCAAAACGTACCCTTGTGACTACACCCGCTTCGCTTCCTCCCCTCTCTAAGCCGGGGAAGCTAAGCC(SEQ ID NO 1)
在本发明中，将SEQ ID NO :1所示的启动子序列称为启动子BgIosP520，或简称为P520启动子。
带有该启动子和⑶S(0 -葡萄糖苷酸酶,其英文名称为0-glucuronidase,简称为GUS)基因的水稻愈伤组织以及转基因水稻苗经GUS染色实验后，所述水稻愈伤组织和转基因水稻苗的根、叶等变为蓝色。带有该启动子和GUS基因的转基因烟草苗经GUS染色实验后，所述转基因烟草苗的根、叶等也变为蓝色。
本发明的又一方面涉及具有与SEQ ID NO :1所示核苷酸序列互补的序列的启动子。
本发明的又一方面还涉及SEQ ID NO :1所示启动子的具有启动子功能的选自如下的变体
I)在高等严紧条件下与SEQ I D NO :1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，
2)对SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，和
3)与SEQ I D NO :1所不的核苷酸序列具有至少90%的序列同一1丨生的核苷酸序列。
典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5°C (低于探针Tm 5°C )高等严紧性”发生在Tm以下约5_10°C;“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20°C ;“低严紧性”发生在Tm以下约20_25°C。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6XSSC=极低严紧性；3XSSC=低至中等严紧性；1XSSC=中等严紧性；0. 5XSSC =高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80%或更多序列同一性的核酸序列。
对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook, J.等(1989)分子克隆,实验室手册，Cold Spring HarborPress, Plainview, N. Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。
为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧条件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(pH8. 0)溶液预洗；在 50-65°C下在 5XSSC 中杂交过夜；随后用含0. 1% SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65°C或65-70°C。
在本发明中，所述在高等严紧条件下与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。
在本发明中，所述对SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个,或者不超过2-30个,或者不超过3-20个,或者不超过4-15个,或者不超过5-10个,或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。
在本发明中，所述对SEQ ID NO : I所示的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列具有与SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。[0028]通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与SEQID NO 1的参考核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ IDNO 1的参考核苷酸序列之每100个核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外,该多核苷酸之核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95%相同的多核苷酸，参考序列中多达5%的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的5% ;或在一些核苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5%。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在这些末端位置之间的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参考序列中。
在本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和BLAST 2. 0 算法，它们分别描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文献中所述或者默认参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可 以通过国立生物技术信息中心(NCBI)为公众所获得。
在本发明中，所述与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列包括与SEQ ID NO :1所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少90%序列同一性、优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的序列同一性的那些序列。
在本发明中，所述与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列具有与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。
本发明中，所述的启动子来源于单子叶植物；具体地，为禾本科；更具体地，为稻属或水稻，例如所述水稻为日本晴(Oryza sativaL. ssp. japonica cv. Nipponbare)。水稻日本晴种子已经于2009年12月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO :P200910，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072 ;水稻日本晴的保藏记载在公开号为CN 101864418A的中国专利申请(申请号为200910249575. 6，
公开日为2010年10月20日)中。
本发明的又一方面，涉及一种核酸构建体，包含本发明的启动子，以及与启动子可操作地连接的基因，其中启动子与基因的来源相同或者不同。
在本发明中，术语“可操作地连接”是指两个或多个核苷酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。在本发明的核酸构建体中，例如，启动子被置于所述基因的核酸序列的特定位置，例如启动子位于所述基因核酸序列的上游位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该基因的核酸序列上。所述基因一般是需要提高转录水平的任何核酸序列，或者，可设计本发明所述启动子和基因以便下调特定核酸序列。也就是通过将启动子与反义方向的基因相连来实现。
所述“可操作地连接”可以通过基因重组的手段实现，具体地，所述核酸构建体为重组核酸构建体。在本发明一个具体的实施方式中，所述基因为⑶S基因。
本发明的又一方面，还涉及一种含有本发明的启动子或核酸构建体的载体。具体地，为重组载体。所述重组载体可以通过将上述启动子或核酸构建体插入到克隆载体或表达载体而得到。
适于构建本发明所述重组载体的克隆载体包括但不限于，例如pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T SimpleVecter、pMD19_T Simple Vecter 等。
适于构建本发明所述的表达载体包括但不限于，例如pBI121、pl3W4、pGEM等。
在本发明的一个实施方案中，所述重组载体为pMD18-T+P520重组载体或p8+P520
重组载体。
本发明的又一方面还涉及含有本发明的启动子或核酸构建体或重组载体的重组细胞。所述重组细胞可以通过将本发明的启动子或核酸构建体或重组载体转化至宿主细胞而得到。
适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如根癌农杆菌细胞LBA4404、EHA105、GV3101 等。
在本发明的一个实施方案中，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞DH5 a -P520或重组根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105-P520。根癌农杆菌 EHA105Agrobacterium tumefaciens EHA105已经于2009年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO M 209315，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072 ;农杆菌EHA105的保藏记载在公开号为CN 101864418A的中国专利申请(申请号为200910249575. 6，
公开日为2010年10月20日)中。
本发明的又一方面还涉及一种含有本发明的启动子或本发明的核酸构建体或本发明的载体或本发明的重组细胞的植物愈伤组织或植物外植体或植物。具体地，所述植物为被子植物，更具体地为单子叶植物或双子叶植物。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物为水稻。所述水稻包括但不限于，例如中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农I号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101 (上述水稻品种均可购自安徽徽商农家福有限公司)等。在本发明的又一实施方案中，所述水稻为日本晴。所述双子叶植物为烟草，具体为烟草K326、K346、K394、NC82、NC89、G140、G28、G80、中烟 90、Cokerl76、或 CV87。其中，烟草 NC89 种子已经于2010年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO P201017，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072。
本发明的又一发明，涉及用于扩增本发明的启动子的引物对，其具有Seq ID NO 2和Seq ID NO :3所示的核苷酸序列；具体地，所述引物对为在Seq ID NO :2和Seq ID NO:3所示核苷酸序列的5’端分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基；更具体地，所述引物对具有Seq ID No 4和Seq ID No 5所示的核苷酸序列。
GTGTAGATAAGTGTTCCGCTG(SEQ ID NO :2)。
GGCTTAGCTTCCCCGGCTT(SEQ ID NO :3)。
GGggtaccGTGTAGATAAGTGTTCCGCTG (SEQ ID NO :4)，其中小写字母代表KpnI 酶切位点。
GCcctgcaggCTTAGCTTCCCCGGCTT (SEQ ID NO :5)，其中小写字母代表 SbfI 酶切位点。
本发明的又一发明，涉及一种制备本发明的启动子的方法，包括下述步骤
I)根据SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对；具体地，PCR扩增引物对为 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO :3，或者为 SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 ；
2)以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用步骤I)中所设计的PCR扩增引物对进行PCR扩增。
本领域技术人员周知，可以根据待扩增的目的核苷酸序列按照碱基互补原则设计相应的PCR扩增引物对。在本发明的一个实施方案中，所述PCR扩增引物对如SEQ ID NO:
2和 SEQ ID NO 3 所示。
本发明的又一方面，还涉及一种调控植物中基因表达的方法，所述方法包括将本 发明的启动子或本发明的核酸构建体或本发明的载体或本发明的重组细胞导入植物的步骤，具体地，导入植物愈伤组织；具体地，包括使用本发明的启动子转化植物愈伤组织的步骤。在本发明的一个实施方案中，所述植物愈伤组织的转化利用了含有本发明的启动子的重组细胞。在本发明的一个实施方案中，所述植物愈伤组织的转化过程中利用了前述的重组农杆菌EHA105-P520。具体地，所述植物为被子植物，更具体地，为单子叶植物或双子叶植物。在本发明的一个具体实施方案中，所述单子叶植物为水稻，具体地，所述水稻为日本晴。在本发明的一个具体实施方案中，所述双子叶植物为烟草，例如烟草NC89。
在本发明中，可采用植物基因转化技术将目的基因插入到植物基因组中，包括农杆菌介导转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。本领域周知，农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物或双子叶植物的基因转化，但其它转化技术也可用于本发明的启动子的转化。当然，适于本发明的转化单子叶或双子叶植物的另一种方法是粒子轰击(显微金或钨粒子包覆转化的DNA)胚性愈伤组织或胚胎开发。另外，还可以采用的转化单子叶或双子叶植物的方法是原生质体转化。基因转化后，采用通用的方法来筛选和再生整合有表达单元的植株。
本发明中，可利用本发明的启动子调控目的基因表达的所述单子叶植物包括但不限于,例如水稻、小麦、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麦等。
烟草是典型的基因工程模式植物。故本发明选择烟草进行转基因研究，以研究本发明的启动子在双子叶植物中的效果。实验结果表明，该启动子能在转基因烟草中起作用。本发明中，可利用本发明的启动子调控目的基因表达的所述双子叶植物包括但不限于，例如烟草、大豆，马铃薯、蚕豆、萝卜、花生等。
本发明的又一方面还涉及本发明的启动子或本发明的核酸构建体或本发明的载体或本发明的重组细胞或本发明的植物愈伤组织或植物外植体或植物在调控植物中目的基因表达中的用途。在本发明的一个实施方案中，利用本发明所述启动子调控的目的基因是GUS。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物为水稻，具体地，所述水稻为日本晴。在本发明的一个实施方案中，所述双子叶植物为烟草，例如烟草NC89。
为实现上述调控目的基因表达的目的，本发明所述启动子可以以单拷贝和/或多拷贝的形式应用，也可以与现有技术中已知的启动子联用。
一种制备转基因植物的方法，包括在有效产生植物的条件下培养本发明的重组细胞或本发明的植物愈伤组织或植物外植体或植物的步骤。[0060]本发明的又一方面还涉及本发明的启动子或本发明的核酸构建体或本发明的载体或本发明的重组细胞或本发明的植物愈伤组织或植物外植体或植物在植物育种中的用途；具体地，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；更具体地，所述单子叶植物为稻属植物或水稻，所述双子叶植物为烟草属植物；进一步具体地，所述水稻为日本晴、中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农I号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207、或津原101，所述烟草属植物为烟草K326、K346、K394、NC82、NC89、G140、G28、G80、中烟 90、Cokerl76、或 CV87。在本发明的一个实施方案中，所述水稻为日本晴。在本发明的一个实施方案中，所述烟草为烟草NC89。
本发明的启动子可成为一种新的启动子作为单子叶植物(尤其是水稻)或双子叶植物(尤其是烟草)转基因的工具启动子，为开展低表达基因转化苗筛选、植物花器官败育等分子育种研究提供便利，从而极大的缩短优良品种的选育时间。本发明的启动子可广泛用于培育水稻、小麦、玉米、小米、甘蔗、高粱、大麦等单子叶植物以及烟草、大豆、马铃薯、蚕豆、萝卜、花生等双子叶植物。
在本发明中，术语“单子叶植物”，具体地，可以为禾本科植物，更具体地，可以为稻属植物例如水稻，包括但不限于，例如日本晴、中花9、中花10、中花11、台北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II优416、II优107、II优128、II优718、准两优527、川农I号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101。
在本发明中，术语“双子叶植物”，具体地，可以为茄科植物，更具体地，可以为烟草属植物例如烟草，包括但不限于烟草K326、K346、K394、NC82、NC89、G140、G28、G80、中烟90、Cokerl76、*CV87。
发明的有益效果
本发明提供了一种新的启动子。所述启动子不仅能够调控单子叶植物(例如水稻)中目的基因的表达，而且能够调控双子叶植物(例如烟草)中目的基因的表达。具体地，所述启动子能够在水稻和基因工程模式植物-烟草中均能够调控GUS基因的表达。


图I :用于构建p8质粒的pCAMBIA-1301质粒示意图。
图2:p8质粒示意图。
图3 p8质粒示意图中多克隆位点和⑶S序列部分的示意图。
图4 :经转化的水稻愈伤组织的GUS染色结果。其中，由带有本发明所述启动子P520序列的重组根癌农杆菌P8+P520转化的水稻愈伤组织(右)经⑶S染色后呈现蓝色；不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌P8质粒的水稻愈伤组织(对照，左)经⑶S染色后颜色未发生变化。
图5:经过转化的转基因水稻苗的根的GUS染色结果。其中，由带有本发明所述启动子P520序列的重组根癌农杆菌P8+P520转化的水稻苗的根(右)经⑶S染色后，呈现蓝色；不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌P8转化的水稻苗的根(对照，左)经⑶S染色后根的颜色未发生变化。
图6:经过转化的转基因水稻苗的叶的GUS染色结果。其中，由带有本发明所述启动子P520序列的重组根癌农杆菌P8+P520转化的水稻苗的叶(右)经⑶S染色后，呈现蓝色；不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌P8转化的水稻苗的叶(对照，左)经GUS染色后叶的颜色未发生变化。
图7:经过转化的转基因烟草苗的叶的GUS染色结果。其中，由带有本发明所述启动子P520序列的重组根癌农杆菌P8+P520转化的烟草苗的叶(右)经⑶S染色后，呈现蓝色；不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌P8转化的烟草苗的叶(对照，左)经GUS染色后叶的颜色未发生变化。
图8:经过转化的转基因烟草苗的根的GUS染色结果。其中，由带有本发明所述启动子P520序列的重组根癌农杆菌P8+P520转化的烟草苗的根(右)经⑶S染色后，呈现蓝 色；不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌P8转化的烟草苗的根(对照，左)经GUS染色后叶的颜色未发生变化。
本发明涉及保藏的生物材料
烟草NC89种子，2010年11月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO :P201017，保藏单位地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例中涉及的N6D培养基、YM液体培养基、YM固体培养基、AAM培养基、N6-AS共培养基、MS-R分化培养基、1/2MS生根培养基，其具体配方可以参考《分子克隆实验指南》或者参考公开号为CN101864418A的中国专利申请(申请号为200910249575. 6，
公开日为2010 年 10 月 20)。
实施例I :P520启动子片段的PCR扩增和dMD18_T+P520重组载体的构津
I) PCR 扩增
使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目录号DP320-02)提取水稻日本晴的基因组DNA，根据该启动子在水稻日本晴gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物(上游引物F1，加限制性酶切位点Kpn I和保护碱基，下游引物R1，加限制性酶切位点Sbf I和保护碱基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA为模板，使用高保真ExTaq (TaKaRa，DRR100B)聚
合酶进行PCR扩增。扩增启动子的PCR体系如下
组成体积(ill)
基因组DNA0.2
dNTPs (2. 5mM)2[0085]IOXEx Buffer (含续离子)2.5
引物Fl(50iiM)I
引物Rl (50 U M)I
Ex taq0. 2
ddH20补满至总体积25 ill
PCR扩增程序为94°C预变性5min，然后以94°C变性45s，55°C退火50s，72°C延伸90s，进行35个反应循环，最后72°C延伸7min。
其中，上游引物Fl:GGggtaccGTGTAGATAAGTGTTCCGCTG(SEQ ID NO :4)，其中小写字母代表KpnI酶切位点。下游引物Rl :GCcctgcaggCTTAGCTTCCCCGGCTT(SEQ ID NO :5)，其中小写字母代表SbfI酶切位点。
PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号DP209-03)进行纯化回收。
2)pMD18_T+P520重组载体的构建
将如上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A)，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序，测序结果证明得到的序列准确。
其中，T/A克隆的连接条件如下
T/A 连接体系10 ill
pMD18-TIU I
2*solution I5 U I
PCR扩增产物(回收插入片段) 10_20ng，根据其浓度定
ddH20补齐至 10 ill
于16 °C在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接8h以上，得到PMD18-T+P520重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌
从超低温冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化隹丐法制备的感受态细胞IOOli I DH5a (中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如上海生工购得)，冰上融化后，加入10 u I如上所得的连接产物，即pMD18-T+P520重组载体，轻轻搅匀，冰浴30min，42°C热激60s，冰浴5min，加入600 u I 4°C预冷的SOC培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37220rpm复苏45min, 8000rpm离心30s，去上清，留取150 yl，用剩下的150 上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB(卡那霉素)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37°C倒置培养16h 24h。获得含有pMD18-T+P520克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5 a -P520。深圳华大基因科技股份有限公司对pMD18_T+P520克隆载体中的P520进行测序，证明获得的PMD18-T+P520克隆载体中P520启动子序列正确。
实施例2 p8+P520重组载体的构津
按照TI ANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号DP103_03)的操作手册，从实施例I构建的转化有启动子P520的大肠杆菌DH5 a -P520中提取带有本发明P520启动子序列的克隆载体PMD18-T+P520 ;纯化后用相应的限制性内切酶KpnI (NEB)和SbfI(NEB)进行酶切，回收相应的启动子插入片段，并分别与P8质粒用相同的限制性内切酶酶切后回收的载体大片段进行连接。
将所得连接产物p8+P520重组载体转化按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞DH5ci，37°C倒置培养16-24h，待转化子长出菌落后，挑取单克隆进行PCR检测和酶切鉴定。
具体操作如下
l)p8质粒构建
本发明中所使用的p8质粒是由pCAMBIA-1301质粒(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如上海国瑞基因科技有限公司购得，该公司的pCAMBIA-1301质粒的原始来源是The CAMBIABios (biological open source) Licensee, Australia)按照如下方式改造并构建的，具体说明如下用Kpn I/Nco I(NEB)双酶切质粒pCAMBIA-1301(参见图1)，回收大片段。根据所采用的限制性内切酶位点合成如下序列GGTACCAAGCTTACTAGTCCTGCAGGTCTAGAGGATCCGTCGACCATGG (SEQ ID NO :6)(包含的酶切位点是 Kpn I/Hind III/Spe I/Sbf I/Pst I/XbaI/BamH I/Sal I/Nco I)，用Kpn I/Nco I双酶切后回收，与上述所回收的大片段连接后转化toplO细胞(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如北京索莱宝科技有限公司购得)。用引物 GCTTCCGGCTCGTATGITGT (SEQ ID NO 7)和 GAGTCGTCGGTTCTGTAAC (SEQIDNO 8)筛选转化子，通过PCR检测方法，带有扩增片段为350bp的转化子即为含有需要构建的多克隆位点及GUS序列的p8质粒的转化子(参见图2)。
所述p8质粒中的多克隆位点和⑶S序列的长度2353碱基，如SEQID NO :9所示(参见图3)
GTTGGCAAGCTGCTCTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTAClGAATT^AGCTClGGTACClAAGCTTlACTAGTlclCTGCAGlGlTCTAGAlGGATCClGTCGAClC^rgm^ TCT
权利要求
1.一种启动子，所述启动子为SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列或与SEQ ID N0:1互补的核苷酸序列。
2.—种核酸构建体，包含权利要求
I所述的启动子，与启动子可操作地连接的基因序列，其中所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。
3.ー种载体，其特征在于所述载体含有权利要求
I所述的启动子或权利要求
2所述的核酸构建体。
4.根据权利要求
3所述的载体，其中，所述载体为权利要求
I所述的启动子或权利要求
2所述的核酸构建体与pMD18-T或p8质粒经重组得到的重组载体。
5.ー种重组细胞，其特征在于所述细胞含有权利要求
I所述的启动子或权利要求
2所述的核酸构建体或权利要求
3或4所述的载体，其中，所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组农杆菌细胞。
6.ー组引物对，所述引物对用于扩增得到权利要求
I所述的启动子，其特征在于所述引物对的两条引物如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。
7.根据权利要求
6所述的引物对，其中，在所述引物对的两条引物的5’端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基。
8.根据权利要求
7所述的引物对，其为SEQID NO :4和SEQ ID NO :5所示的序列。
9.制备SEQID NO :1所示的启动子的方法，包括下述步骤 以水稻日本睛基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQID NO 1在水稻日本睛基因组DNA中的序列分别针对首尾进行设计。
10.根据权利要求
9所述的方法，其中，所述引物对是权利要求
6至8中任一项所述的引物对。
11.一种调控植物中基因表达的方法，所述方法包括，将权利要求
I所述的启动子或权利要求
2的核酸构建体或权利要求
3或4的载体或权利要求
5的重组农杆菌细胞导入植物的步骤。
12.根据权利要求
11所述的方法，其中，所述导入植物为导入植物愈伤组织。
13.根据权利要求
11或12所述的方法，其中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
14.根据权利要求
11或12所述的方法，其中，所述植物为稻属或烟草属。
15.根据权利要求
11或12所述的方法，其中，所述植物为水稻或烟草。
16.根据权利要求
11或12所述的方法，其中，所述植物为水稻日本睛或烟草NC89。
17.ー种制备转基因植物的方法，包括在有效产生植物的条件下培养植物愈伤组织或植物外植体或植物的步骤，其中，所述植物愈伤组织或植物外植体或植物含有权利要求
I的启动子或权利要求
2的核酸构建体或权利要求
3或4的载体或权利要求
5的重组农杆菌细胞。
18.根据权利要求
17所述的方法，其中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
19.根据权利要求
17所述的方法，其中，所述植物为稻属或烟草属。
20.根据权利要求
17所述的方法，其中，植物为水稻或烟草。
21.根据权利要求
17所述的方法，其中，所述植物为水稻日本睛或烟草NC89。
22.权利要求
I所述的启动子、或权利要求
2的核酸构建体、或权利要求
3或4的载体、或权利要求
5的重组农杆菌细胞、或含有权利要求
I的启动子或权利要求
2的核酸构建体或权利要求
3或4的载体或权利要求
5的重组农杆菌细胞的植物愈伤组织或植物外植体或植物在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途。
23.根据权利要求
22所述的用途，其中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
24.根据权利要求
22所述的用途，其中，所述植物为稻属或烟草属。
25.根据权利要求
22所述的用途，其中，植物为水稻或烟草。
26.根据权利要求
22所述的用途，其中，所述植物为水稻日本睛或烟草NC89。
专利摘要
本发明属于分子生物学领域，涉及一种启动子BgIosP520、其制备方法及用途。具体而言，本发明所述启动子具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或其具有启动子功能的选自如下的变体1)在高等严紧条件下与SEQ ID NO1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，2)对SEQ ID NO1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，和3)与SEQ ID NO1所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同一性的核苷酸序列。本发明还涉及所述启动子的制备方法以及所述启动子在调控单子叶植物或双子叶中目的基因表达和水稻或烟草育种中的用途。
文档编号C12N15/113GKCN102146391 B发布类型授权 专利申请号CN 201010614973
公开日2013年2月27日 申请日期2010年12月30日
发明者张耕耘, 李宁, 倪雪梅, 张印新 申请人:深圳华大基因科技有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3),