[0047] 以栽培大豆（Glycine max(L. )Merr. ) Williams82为材料，采用CTAB法提取大豆 根系基因组DNA。根据大豆基因组数据库查找PRP2基因及其上游序列，设计特异引物上游 引物Fl和下游引物R1，以提取的总DNA为模板，进行PCR扩增。
[0048] Fl :5' -ATTTTCCGGACAAACTCTGG-3'（序列 1 的第 1-20 位）；
[0049] Rl :5'-TGGGGGGTTTTCAACTGG-3'（序列 1 的第 1219-1236 位的反向互补序列），
[0050] 反应程序：94°C 5min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 2min，35 个循环；72°C延伸 lOmin。
[0051 ] 反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
[0052] 结果见图1，其中，泳道M为DL2000的DNA分子量标准，泳道1为PCR产物。用回收 试剂盒纯化回收PCR产物，PCR产物回收后与pEASY-Tl载体(全式金公司，目录号：CTlOl) 连接，连接产物转化E. coli感受态细胞DH5a (TIANGEN，目录号：CB101)，提取质粒，经PCR 扩增为阳性的重组质粒送去测序。测序结果表明，PCR产物为1236bp，如序列1所示，其中 包括174bp PRP2基因 CDS序列（序列1的第1063-1236位）。
[0053] 为了得到不含PRP2基因 CDS序列的启动子片段，从翻译起始密码子ATG开始，新 设计了一条下游引物R2进行第二轮PCR扩增，以第一轮PCR产物(序列1)为模板，以Fl和 R2为引物进行第二轮PCR扩增。
[0054] Fl :5' -ATTTTCCGGACAAACTCTGG-3'（序列 1 的第 1-20 位）；
[0055] R2 :5' -GGTTTCTCACGTTGTAGTTG-3'（序列 1 的第 1043-1062 位的反向互补序列）。
[0056] 反应程序：94°C 5min ;94°C 30s，52°C 30s，72°C 2min，35 个循环；72°C延伸 lOmin。
[0057] 反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
[0058] 结果见图2,其中，泳道M为DL2000的DNA分子量标准，泳道1为PCR产物。用回 收试剂盒纯化回收PCR产物，PCR产物回收后与pEASY-Tl载体连接，连接产物转化E. coli 感受态细胞DH5a，提取质粒，经PCR扩增为阳性的重组质粒送去测序。测序结果得到了 1062bp的GmPRP2p全长启动子序列，如序列2所示，命名为GmPRP2p-1062。将测序正确的 重组质粒命名为pEASY-GmPRP2p-1062。
[0059] 实施例2、含有GmPRP2p-1062启动子5'缺失片段的系列重组表达载体的构建
[0060] -、大見GmPRP2p_1062启动子序列5'缺失序列的获得
[0061] 本发明的发明人对GmPRP2p-1062序列的5'进行了缺失。根据GmPRP2p-1062序 列（序列2)，分别设计了 2条上游引物（F-852、F-369)，以R2为下游引物，以实施例1获得 的重组质粒pEASY-GmPRP2p-1062为模板，分别进行PCR扩增。
[0062] 引物序列如下：
[0063] F-852 :5' -ATGGAAATTGCAAATG-3'（序列 2 的第 211-226 位）；
[0064] F-369 :5' -TCCCATGCCATAATGCG-3'（序列 2 的第 694-710 位）；
[0065] R2 :5' -GGTTTCTCACGTTGTAGTTG-3'（序列 2 的第 1043-1062 位的反向互补序列）。
[0066] 反应程序：94°C 5min ;94°C 30s，54°C 30s，72°C lmin，35 个循环；72°C延伸 lOmin。
[0067] 反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
[0068] 结果如图3所示。将所得两种PCR产物分别进行测序，结果显示：引物对F-852/R2 扩增所得PCR产物的序列为序列2的第211-1062位(命名为GmPRP2p-852);引物对F-369/ R2所得PCR产物的序列为序列2的第694-1062位(命名为GmPRP2p-369)。
[0069] 将以上2种PCR产物分别与pEASY-Tl载体连接，依据所得重组质粒中外源片段的 不同，依次命名为 pEASY-GmPRP2p-852、pEASY-GmPRP2p-369。
[0070] 二、含有GmPRP2p-1062启动子5'缺失片段的系列重组表达载体的构建
[0071] 将步骤一获得的 pEASY-GmPRP2p-852、pEASY-GmPRP2p-369 分别进行 Sac I 和 Xba I (pEASY-Tl载体上自带酶切位点）双酶切，回收酶切产物，将所得2种回收片段分别 与经过同样双酶切的PC13P1载体(质粒图谱如图5所示)的骨架大片段相连(酶切图谱如图 4所示)，获得2种重组质粒。将经酶切鉴定正确的质粒送样测序。将经测序表明在pC13Pl 载体的多克隆位点Sac I和Xba I之间插入含有序列表中序列2的第211-1062位核苷酸 的DNA片段的重组质粒命名为pCAM-PRP2p-852 ;将经测序表明在pC13Pl载体的多克隆位 点Sac I和Xba I之间插入含有序列表中序列2的第694-1062位核苷酸的DNA片段的重 组质粒命名为pCAM-PRP2p-369。
[0072] 在重组表达载体pCAM-PRP2p-852和pCAM-PRP2p-369中，相应启动子 (GmPRP2p-852和GmPRP2p-369)均位于⑶S基因上游，驱动⑶S基因的转录，同时在⑶S基 因下游均连接有终止其转录的NOS终止子。
[0073] 实施例3、转GmPRP2p-852和GmPRP2p-369拟南芥的获得及表达特性研究
[0074] -、浸花法转化拟南芥及鉴定
[0075] YEP液体培养基：溶剂为水，溶质及其浓度如下：5g/L NaCl，5g/L酵母提取物， l〇g/L胰蛋白胨；pH7.0。各浓度为相应组分在培养基中的终浓度。
[0076] 1/2MS固体培养基：溶剂为水，溶质及其浓度如下：2. 17g/L MS盐（Phyto Tech，目 录号：M524)、7g/L琼脂、30g/L蔗糖，lml/L MS有机（Phyto Tech,目录号：Μ533)，ρΗ5·8。各 浓度为相应组分在培养基中的终浓度。
[0077] 1、用实施例2获得的两种重组质粒pCAM-PRP2p-852和pCAM-PRP2p-369,以及 PC13P1空载体分别转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，得到3种重组农杆菌。将3种重 组农杆菌分别接种于YEP液体培养基(含卡那霉素50mg/L)，28°C、220rmp振荡培养，得到 0D600=0. 4-0. 6的3种重组农杆菌菌液。
[0078] 2、将pC13 (Delta)⑶S载体(质粒图谱如图6所示）转化根癌农杆菌GV3101感 受态细胞，得到重组农杆菌。将重组农杆菌接种于YEP液体培养基(含卡那霉素50mg/L)， 28°C、220rmp振荡培养，得到0D600=0. 4-0. 6的重组农杆菌菌液。
[0079] 3、将步骤1得到的3种重组农杆菌菌液分别与步骤2中的重组农杆菌菌液按体积 比1:1混合，加入0. 5% (v/v) silwet L-77,共得到3种农杆菌混合液，用来浸染植株。
[0080] 4、浸染植株的准备：将拟南芥（Arabidopsis thaliana (L. )Heynh. )Columbia 的 种子在10%(v/v)次氯酸钠的水溶液中消毒15min，用无菌水洗3-4次后，将种子种于1/2MS 固体培养基上，4°C培养3d后，置于22°C培养箱中培养，光照16h/黑暗8h。生长2周的植 株从培养基中移栽到土壤基质中继续生长，生长到开花期的拟南芥用来浸染。
[0081] 5、浸染：将上述步骤4中生长到花期的拟南芥植株在步骤3中制备好的3种农杆 菌混合液中浸泡lmin，浸染后的植株遮光过夜，浸染第二天后，恢复正常培养，一周后采用 同样方法对植株进行第二次浸染。直至收获T 1代种子。
[0082] 6、将收获的Tl代种子消毒后，种植于含50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上，4°C培 养3d后，置于22°C培养箱中培养，光照16h/黑暗8h，筛选出能够正常生长的植株，将生长 2周的植株从培养基中移栽到土壤基质中继续生长，收获T 2代种子。同时提取T1代植株的 基因组DNA，进行PCR检测。具体如下：以基因组DNA为模板，对于转入pCAM-PRP2p-852的 抗性转基因拟南芥，采用引物对F-852/R2进行PCR检测，得到大小约为852bp目的条带(序 列2的第211-1062位)的拟南芥为阳性。对于转入pCAM-PRP2p-369的抗性转基因拟南芥， 采用引物对F-369/R2进行PCR检测，得到大小约为369bp目的条带(序列2的第694-1062 位）的拟南芥为阳性。各处理均同时设置以未转基因的拟南芥基因组DNA代替模板的阴性 对照，以及以对应质粒代替模板的阳性对照。PCR检测结果如图7所示。
[0083] 7、检测出目的条带的株系，其T2代种子采用步骤6中同样的方法种植培养，收获 T3种子，选择T3代不再分离的纯合株系的种子用来后续的试验。