网络图形11和立柱12转移至所述第一薄膜层20后分别形成细胞网络培养池21和纵向贯通的孔道22 (结合图1所示)。
[0038]步骤二:在光刻胶SU8-2050刻蚀出凸型的流道结构，然后进行硅烷化处理2分钟形成第二模板(图中未示出)。然后将所述预聚物与固化交联剂的混合液(质量比为10:1)浇注在所述第二模板上，真空环境下排除气泡10分钟，最后移入烘箱中80°C烘烤30分钟，获得透明的第二结构层30，如图2 (C)。
[0039]由此形成的第二结构层30上设有流道结构31，具体地，这种流道结构31可例如为若干条并排设置的微流道(参见图3)。流道结构31上排列若干个连通外界与流道结构31的支管32，从流道结构31输送的细胞培养基便可从各个支管32流入孔道22、继而到达细胞网络培养池21。为达到上述目的，支管32的开设与所述立柱12 (相当于第一薄膜层20的孔道22)位置对应，且为了保证第一薄膜层20、第二结构层30的平整性，支管32的高度大于所述立柱12高度，支管32高度优选为50?70微米。对于支管32与孔道22的相对宽度，并没有严格要求，一般10微米以内均可。不过为了让细胞及其培养基顺利流入孔道22，优选支管32较孔道22要宽一些。
[0040]步骤三:将所述第二结构层30从第二模板中剥离，在体式显微镜辅助下将第二结构层30盖设于所述第一薄膜层20表面，如图2 (d)所示，使所述支管32与第一模板10的立柱12相对应，突出于第一薄膜层20表面的部分立柱12便伸入至支管32内。然后将所述第一薄膜层20、第二结构层30 —并送入烘箱中80°C烘烤120分钟，使所述第一薄膜层20、第二结构层30粘结在一起。
[0041]步骤四:将经过步骤三热固化处理后的所述第一薄膜层20、第二结构层30从所述第一模板10上剥离，并在第二结构层30的流道结构31上制作用于细胞培养基流通的出口孔34、入口孔34，此时获得微流控芯片(结合图1所示)。
[0042]步骤五:为了进一步保证微流控芯片结构的稳固性，将所述微流控芯片置于一干净载玻片40上进行等离子处理(800W，10s)，再送入烘箱中80?100°C烘烤过夜。
[0043]对于贴壁细胞来讲，其生长方式会受限于二维的平面结构。根据这个细胞的生长特性，利用上述微流控芯片设计的双层结构可获得完美的细胞网络。其中，位于上层的第二结构层，通过其流道结构完成细胞及其培养基的输送，位于下层第一薄膜层则通过纵向贯通的孔道接收从流道结构的支管流下的细胞及其培养基。同时，由于细胞的密度比培养基大，在接种的过程中会逐渐下沉到孔道底部，这样可以利用一个贯通上下层的三维通孔结构来实现固定细胞的接种位置。在接种细胞过后，流道结构中的细胞会随培养基输送而冲走，而沉到孔道中的细胞会继续沿着预定的网络结构流动至细胞网络培养池中生长，最后形成特定的细胞网络。
[0044]上述微流控芯片在实际应用中体现出优异的可重复性和易操作性。本发明提供不同种类的细胞在该微流控芯片的细胞网络生长实验。所实验的细胞类型包括对PLL包被敏感的原代大鼠海马体神经元细胞(编号:1号)和对PLL包被不敏感的PC-12神经样细胞(编号:2号)。实验结果证明本发明的微流控芯片可以非常有效地将I号细胞和2号细胞形成预定的细胞网络结构。并且在继续培养的后期，两种细胞的网络结构更加明显和成熟，但不会生长至细胞网络培养池之外。
[0045]本发明的微流控芯片，一方面为细胞生长提供一相对封闭的环境，从而能有效避免污染源入侵；另一方面，可以为多类型的细胞提供一个复杂多样的网络结构，解决了对PLL包被不敏感的细胞难以形成细胞网络的问题，使得各种类型的细胞均能在预设的网络结构中生长，且不会有细胞生长到网络结构之外的区域，为细胞网络的科学研究提供一有利的应用平台。
【主权项】
1.一种构建细胞网络的三维微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一:提供一设有相互连通的网络图形和立柱的第一模板，在所述第一模板上形成厚度不小于所述网络图形高度、且小于所述立柱高度的第一薄膜层，所述网络图形和立柱结构用于转移至所述第一薄膜层上形成细胞网络培养池和纵向贯通的孔道； 步骤二:在第二模板上形成设有流道结构的第二结构层，所述流道结构上排列有若干个连通外界与所述流道结构的支管；其中，所述支管与所述立柱对应；所述支管的高度大于所述立柱高度； 步骤三:将所述第二结构层盖设于所述第一薄膜层表面，使所述支管与所述立柱相对应，然后热固化处理所述第一薄膜层、第二结构层； 步骤四:将经过步骤三处理后的所述第一薄膜层、第二结构层从所述第一模板上剥离，并在所述流道结构上制作用于细胞培养基流通的出口孔、入口孔，获得所述微流控芯片。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一薄膜层、第二结构层是由预聚物与固化交联剂的混合液分别浇注在第一模板、第二模板上，热固化处理后形成；所述预聚物与固化交联剂质量比为10?20:1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，控制所述网络图形高度为5?10微米、所述立柱高度为40?50微米。
4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，所述第一薄膜层厚度为10?20微米。
5.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，所述支管的高度为50?70微米。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述热固化处理为在80?100°C下烘烤30?120分钟。
7.—种构建细胞网络的三维微流控芯片，其特征在于，包括: 第一薄膜层，其设有细胞网络培养池和纵向贯通的孔道，所述细胞网络培养池与所述孔道连通；以及 设有流道结构的第二结构层；所述流道结构上排列有若干个连通外界与所述流道结构的支管，以及用于细胞培养基流通的出口孔、入口孔； 所述第二结构层盖设于所述第一薄膜层表面；所述支管与所述孔道相对应。
8.根据权利要求7所述微流控芯片，其特征在于，所述第一薄膜层、第二结构层是由预聚物与固化交联剂的混合液浇注，热固化处理后形成；所述预聚物与固化交联剂质量比为10 ?20:1。
9.根据权利要求7所述微流控芯片，其特征在于，所述第一薄膜层厚度为10?20微米。
10.根据权利要求7或9所述微流控芯片，其特征在于，控制所述细胞网络培养池的高度为5?10微米。
11.根据权利要求7所述微流控芯片，其特征在于，所述支管的高度为50?70微米。
【专利摘要】本发明涉及微流控芯片技术领域，尤其是指一种构建细胞网络的三维微流控芯片及其制备方法，这种微流控芯片包括：第一薄膜层，其设有细胞网络培养池和纵向贯通的孔道，所述细胞网络培养池与所述孔道连通；以及设有流道结构的第二结构层；所述流道结构上排列有若干个连通外界与所述流道结构的支管，以及用于细胞培养基流通的出口孔、入口孔；所述第二结构层盖设于所述第一薄膜层表面；所述支管与所述孔道相对应。本发明还提供这种微流控芯片的制备方法。本发明解决了对PLL包被不敏感的细胞难以形成细胞网络的问题，为细胞网络的科学研究提供一有利的应用平台。
【IPC分类】C12M1-00
【公开号】CN104745445
【申请号】CN201310746728
【发明人】舒伟良, 陈艳
【申请人】中国科学院深圳先进技术研究院
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年12月30日