基因、小麦泛素基因、小麦果糖-1，6-二磷酸酯酶基因、水稻谷蛋白基 因、水稻乳酸脱氢酶基因和水稻β微管蛋白基因，所有这些基因都在美国出版的专利申请 2002/0192813 Al中公开，纳入此处作为参加文献；以及豌豆（Pisum sativum)核酮糖二磷 酸羧化酶基因 （rbs 3')和来自于宿主植物内基因的3'元件。
[0042] 基因结构和载体也可以包含导肽以使基因产物定位至植物细胞器，特别是叶绿 体、无色体或其它质体细胞器。为阐述叶绿体导肽的作用，请见美国专利No. 5, 188, 642和 No. 5, 728, 925,其中纳入作为参考文献。为阐述本发明中有用的拟南芥EPSPS基因导肽区， 请见 Klee，HJ.等（MGG (1987) 210:437-442)。
[0043] 转基因植物，包括或源自于本发明中由重组DNA转化的植物细胞，可由于叠加 性状而被进一步改良，例如，一种具有改良性状的玉米植物，由于表达了其中公开的DNA， 可兼有抗除草剂和/或抗虫害的性状。例如，本发明的基因可以与其它农业上感兴趣的 性状叠加，如能抗除草剂或抗昆虫害的性状，如使用来源于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringensis)的基因来产生对鳞翅类、coliopteran、同翅类、半翅类和其它昆虫的抗性。 转基因植物表现出耐受并在本发明的方法中得以应用的除草剂包括但不仅限于草甘膦、麦 草畏、草铵膦、磺酰脲类、溴草腈和达草灭。编码抗除草剂相关蛋白的多聚核苷酸分子在本 领域众所周知，包括但不仅限于编码5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS)的多 聚核苷酸分子，于美国专利5, 094, 945 ;5, 627, 061 ;5, 633, 435和6, 040, 497公开，应用于 表现草甘膦抗性。编码草甘膦氧化还原酶（GOX)和草甘膦-N-乙酰转移酶（GAT)的多聚 核苷酸分子分别在美国专利5, 463, 175和美国专利申请公开物2003/0083480 Al中公开， 它们也能应用于表现草甘膦抗性；在美国专利申请公开物2003/0135879 Al中公开的麦 草畏加单氧酶能表现出麦草畏抗性；美国专利4, 810, 648公开的编码溴草腈水解酶（Bxn) 的多聚核苷酸分子能用于表现溴草腈抗性；编码八氢番茄红素去饱和酶（crtl)的多聚核 苷酸分子用于达草灭抗性在Misawa等，（1993)Plant J. 4 :833-840和Misawa等，（1994) Plant J. 6 :481-489的文章中有所阐述；编码乙酰羟酸合成酶（AHAS，okaALS)的多聚核 苷酸分子用于表现磺酰脲类除草剂抗性在Sathasiivan等·（1990)Nucl. Acids Res. 18 : 2188-2193的文章中有所阐述。多聚核苷酸分子如bar基因，在DeBlock，等.（1987)EMSO J. 6 :2513-2519文章中公开，可应用于glufosinate和bialaphos抗性；美国专利申请公 开物2003/010609 Al公开的多聚核苷酸分子用于表现N-氨基甲基膦酸抗性；美国专利 6, 107, 549公开的多聚核苷酸分子能表现出吡啶除草剂抗性；对于表现对多种除草剂，如 草甘膦、阿特拉津、ALS抑制剂、isoxoflutole和glufosinate，抗性使用的分子和方法在美 国专利6, 376, 754和美国专利申请公开物2002/0112260中公开，所有所述美国专利和美国 专利申请公开物均纳入此处作为参考文献。对于表现对昆虫/线虫/病毒抗性所用的分子 和方法在美国专利5, 250, 515 ;5, 880, 275 ;6, 506, 599 ;5, 986, 175和美国专利申请公开物 2003/0150017 Al中公开，均其中纳入作为参考文献。
[0044] 在特殊的具体实施方案中，发明者期望使用能与此处公开蛋白结合的抗体，或者 是单克隆或者是多克隆。用于制备和特异化抗体的方法在其领域中是熟知的（比如见 Antibodies :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988,纳入此处作为 参考文献）。产生单克隆抗体（mAbs)的方法刚开始时与制备多克隆抗体是一样的。简要 地说，多克隆抗体是按照本发明方法用免疫原性化合物免疫动物并从被免疫动物上收集抗 血清而制备的。很多种类的动物可以用来制备抗血清。典型的用于生产抗血清的动物有兔 子、小鼠、大鼠、仑鼠、豚鼠或山羊。因为兔子有相对大的血容量，所以兔子是生产多克隆抗 体的优先选择。
[0045] 本领域公知给定化合物可能有不同的免疫原性。因此加强刺激宿主免疫系统常 常是必要的，可以通过将多肽或多肽抗原偶联在一个载体上达到效果。可作为范例和优 选的载体是钉形贝血蓝蛋白（KLH)和牛血清白蛋白（BSA)。其它白蛋白如卵清蛋白、小 鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也能被作为载体。偶联多肽和载体蛋白方法在本领域众 所周知，包括使用戊二醛、间马来酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和 bis-biazotized 联苯胺。
[0046] 本领域也公知，对一个特殊的免疫原组分，其免疫原性可以利用免疫反应的非特 异性刺激而被加强，如大家所知的佐剂。可作为范例和优选佐剂包括弗氏完全佐剂（一种 免疫反应的非特异刺激物，含有灭活的结核分支杆菌），弗氏不完全佐剂和氢氧化铝佐剂。
[0047] 用于生产多克隆抗体的免疫原组分的量可以因免疫原的性质和被免疫动物的不 同而变化。免疫原的给药途径也可以不同（皮下注射、肌肉注射、真皮内注射、静脉注射和 腹膜注射）。多克隆抗体产量可以在免疫之后不同的时间点采取被免疫动物的血样进行监 控。也可以给予二次加强注射。重复加强和滴度测定过程直到得到合适的抗体滴度。当获得 期望的免疫程度时，将被免疫动物放血，分离血清并贮存，和/或将该动物用于产生mAbs。
[0048] mAbs可以使用熟知的技术很容易地制备，如美国专利No. 4, 196, 265所例举的方 法，纳入此处作为参考。典型的这种技术包括使用所选的免疫原组分免疫合适的动物，例如 一种纯化的或部分纯化的抗真菌蛋白、多肽或肽。免疫组分用一定方式给药以有效地刺激 产生抗体的细胞。啮齿类如小鼠和大鼠是优选动物，而也可能用兔子和绵羊或青蛙细胞。使 用大鼠可能有某些优势（Goding，1986, pp. 60-61)，但小鼠是优选的，BALB/c小鼠是最优选 择，因为它最为常用并通常可产生高比例的稳定融合。
[0049] 免疫之后，具有产生抗体潜能的体细胞，特别是B淋巴细胞（B细胞），被筛选出来 于HlAb生产。这些细胞可以从活体的脾脏、扁桃体或淋巴结中获得，或从外周血中取样。脾 细胞和外周血细胞是优选，前者是因为它是抗体生成细胞的富有源，并且这些细胞正处于 分化浆母细胞阶段；后者是因为外周血易于获取。通常，一组动物在免疫后，具有最高抗体 滴度的脾将被切除下来，用注射器均浆后可得到脾淋巴细胞。典型地说，从一个被免疫老鼠 的脾脏中可获得大约5 X IO7到2 X 10 8个淋巴细胞。
[0050] 将来源于被免疫动物的产生抗体的B淋巴细胞与永生的骨髓瘤细胞融合，这种细 胞通常来自与被免疫动物同一种类的动物。适合于杂交瘤融合操作的骨髓瘤细胞系，应优 选无抗体产生、具有高融合效率和酶缺陷型细胞系，这样在只支持期望的融合细胞（杂交 瘤）生长的选择性培养基中，未融合细胞则不能生长。
[0051] 为本领域的技术人员所熟知，许多骨髓瘤细胞中的任何一种都可用（Goding， 1986, ρρ· 65-66 ;Campbell，1984, ρρ· 75-83)。例如，当使用小鼠作为被免疫动物时，可用 P3-X63/Ag8, X63-Ag8. 653, NS1/1. Ag 41，Sp210-Agl4, F0, NSO/U，MPC-11，MPC11-X45-GTG I. 7 和 S194/5XX0 细胞系；对于大鼠，则可用 R210. RCY3, Y3-Ag I. 2· 3, IR983F 和 4B210 细 胞系；而U-266, GM1500-GRG2, LICR-L0N-HMy2和UC729-6细胞系则全部用于与人类细胞融 合。
[0052] -种优选的鼠类骨髓瘤细胞是NS-I骨髓瘤细胞系（也被命名为P3-NS-1-Ag4_l)， 该细胞可以很容易地从国立普通医学科学研宄所人类遗传变异细胞贮存库获得，索求细胞 系贮存号为GM3573。另一种可用的小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠骨髓瘤细 胞非SP2/0生成细胞系。
[0053] 用于产生抗体生成脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂合体的方法通常包括，以 2 : 1的比例混合体细胞与骨髓瘤细胞，在有一种或多种促细胞膜融合因子（化学的或电 的）的存在下，这个混合比例可以分别从大概20 : 1到I : 1不等。（Kohler和Milstein， 1975 ;1976)文中阐述了使用Spend病毒融合的方法，也有使用聚乙二醇（PEG)，如37% (v/v)PEG的方法（Gefter等，1977)。使用电介导融合的方法也能适用（Goding，1986， ρρ·71-74)〇
[0054] 融合操作产生的可传代杂合体的几率常常较低，大约I X KT6到1x10 Λ但是这并 不成什么问题，因为在选择性培养基中培养时，可传代的融合杂合体可以由亲代未融合的 细胞分化（特别是未融合的骨髓瘤细胞通常可以继续不定地分裂）而来。一般来说，选择 性培养基是含有一种能阻断核苷酸新合成的试剂的组织培养基。可作为范例和优选的试剂 是氨喋呤、甲氨喋呤和氮丝氨酸。氨喋呤和甲氨喋呤可同时阻断嘌呤和四氢化吡咯的新合 成，而氮丝氨酸只阻断嘌呤合成。当使用氨喋呤和甲氨喋呤时，培养基需补加次黄嘌呤和脱 氧胸苷作为核苷酸来源（HAT培养基）。当使用氮丝氨酸时，培养基中应补加次黄嘌呤。
[0055] 培养基优选HAT。只有能进行核苷酸补救途径的细胞才能在HAT培养基中存活下 来。骨髓瘤细胞缺乏补救途径的关键酶，如次黄嘌呤转磷酸核糖基酶（HPRT)，不能存活下 来。B细胞能进行这种途径，但是它们在培养时生命有限，通常在大约两周之内死亡。所以， 能生存于选择性培养基中的细胞只有由骨髓瘤细胞和B细胞形成的杂合体。
[0056] 这种培养能提供一个杂交瘤细胞种群，从中特异的杂交瘤细胞可被筛选出来。典 型地说，杂交瘤细胞的筛选是这样进行的，先在微量滴定板中培养单克隆稀释后的细胞，然 后测定各单克隆上清液以检测期望的活性（在大约两周或三周之后）。测定应该灵敏、简单 和快速，如放射免疫测定法、酶免疫测定法、细胞毒性测定法、噬菌斑测定法、圆点免疫结合 测定法等诸如此类。
[0057] 所选择的杂交瘤细胞再进行连续稀释并克隆成为单一抗体生成细胞，这样这些克 隆就能无繁殖用于产生单克隆抗体。该细胞系可以通过两种基本方法用来生产mAb。一个 例子就是将杂交瘤注射进一个动物体内（常常是注射入腹膜腔内），该动物与提供最初融 合所用体细胞和骨髓瘤细胞的动物类型之间组织相容。被注射的动物体内生长出能分泌由 融合细胞杂合体产生的特异单克隆抗体的肿瘤。动物的体液，如血清或腹积液，可被抽出以 提供高浓度的mAbs。单个细胞系也可以在体外进行培养，这时，mAbs就自然地分泌进入培 养基中，从培养基里可以很容易地得到高浓度的抗体。如果希望的话，