两种方法生产的mAbs 都可被进一步纯化，可用过滤、离心和各种层析方法，如HPLC或亲和层析进行。
[0058] 植物细胞转化方法
[0059] 为本领域所熟知的，有许多方法可以用于重组DNA转化植物细胞，这些方法也 可用于本发明中。两个通常使用的转化植物的方法是农杆菌介导的转化和微粒轰击。 微粒轰击方法在美国专利5, 015, 580(大豆）；5, 550, 318(玉米）；5, 538, 880(玉米）； 5, 914, 4δ1 (大豆）；6, 16〇, 2〇8 (玉米）；6, 3"，86I (玉米）和 6, I53, 8I2 (水稻）中有 图解说明，农杆菌介导的转化方法在美国专利5，159，135(棉花）；5,824,877(大豆）； 5, 591，616 (玉米）；和6, 384,301(大豆）中得以阐述，所有以上专利均纳入此处作为参考。 对于基于根癌农杆菌的植物转化系统，在转化构建中出现的附加元素包括T-DNA的左缘和 右缘序列，它们能使重组多聚核苷酸很方便地整合进入植物基因组。
[0060] 通常，随机导入重组DNA，即非特异地定位于目标植物种系的基因组里，都是有用 的。在一些特殊的例子中，定位重组DNA的插入以得到位点特异性的整合可能是有用，例 如，用于取代一个基因组中已经存在的基因，利用植物基因组中已经存在的启动子或者插 入重组的多聚核苷酸到一个预先确定的位点，该位点是已知活跃的基因表达位点。已知有 几个位点特异性重组系统在植物中有效，包括美国专利4, 959, 317中公开的cre-lox，美国 专利5, 527, 695中公开的FLP-FRT，两者均纳入此处作为参考文献。
[0061] 本发明的转化方法优选地应用于培养基和受控环境中的组织培养。"培养基"指在 体外，即在完整的活器官之外，培养细胞所用的许多营养物质的混合物。受体细胞目标包括 但不仅限于分生组织细胞、愈伤组织细胞、未成熟胚细胞和配子细胞如小孢子、花粉、精子 和卵细胞。任何可以再生成为可育植物的细胞均可以考虑用来作为受体细胞。本发明中用 于产生转基因植物的实际转化方法和材料，例如各种不同的培养基、受体目标细胞、未成熟 胚细胞转化和可育转基因植物的后继再生，均在美国专利6, 194, 636和6, 232, 526中公开， 其中纳入作为参考。
[0062] 转基因植物的种子可以从可育转基因植物收获，并用来种植本发明所述转化植物 的子代，包括用于选择具有改良性状植物的杂合植物株系。除了使用重组DNA进行直接转 化，转基因植物也可以通过带有重组DNA的植物与不带重组DNA的植物的杂交而获得。例 如，重组DNA能被导入第一种植物株系转化产生转基因植物，这种转基因植物可与第二种 植物株系杂交而使重组DNA渗入第二种植物株系中。将具有提供一种改良性状，如提高产 量，的重组DNA的转基植物可以与具有提供另一种性状，如抗除草剂或抗虫害，的重组DNA 的转基植物杂交，可以产生具有提供两种性状的重组DNA的子代。典型地说，在对组合性状 的这种培育中，提供附加性状的转基因植物是父系，而带有基础性状的转基因植物则是母 系。这种杂交产生的子代将出现性状分离，以至于有些植物可携带同时表现双亲性状的DNA 而有些则带有只表现一个亲本性状的DNA ;这样的植物可以用与亲本重组DNA偶联的标记 进行鉴定，如通过对重组DNA分析进行的标记鉴定，或者在一些例子中，一个可选标记连接 在重组DNA上，通过使用选择试剂，如除草剂来鉴定除草剂耐受型标记，或选择改良性状加 以鉴定。带有能表现亲本双方性状DNA的子代植物可以与母本系进行多次回交，比如通常 6至8代，以产生具有与初始转基因亲本之一基本上相同的基因型的子代植物，要不是有另 一个转基因亲本的重组DNA。
[0063] 实际上，在任何一次转基因实验中，转化DNA -般只能导入很小比例的目标植物 细胞中。标记基因用于提供一个有效的系统来鉴定那些通过接收和整合转基因 DNA进入自 己基因组的稳定转化细胞。优选的标记基因提供能对选择试剂产生耐受性的选择性标记， 如抗生素或除草剂。任何一种除草剂，只要本发明中的植物可以耐受，都可以用作鉴定选择 性标记的试剂。将可能被转化的细胞用选择试剂处理。对于存活的细胞种群，一般来说，提 供耐受性的基因是整合的，并能以足够高的水平进行表达以维持细胞存活。细胞可以被进 一步地测定以确定外源DNA的稳定整合。常用的选择标记基因包括那些对抗生素产生抗性 的基因，如卡那霉素和巴龙霉素（nptll)、潮霉素 B(aph IV)和庆大霉素（aac3和aacCA)， 或抗除草剂的基因如glufosinate (bar或者pat)和草甘膦（aroA或者EPSPS)。对这些选 择性的实例在美国专利5, 550, 318 ;5, 633, 435 ;5, 780, 708和6, 118, 047中有图注说明，所 有纳入此处作为参考。能够使肉眼观察就能鉴定转化体的可选择标记也可以使用，比如表 达有色或荧光蛋白，如荧光素酶或绿色荧光蛋白（GFP)，的基因，或者表达β-葡糖苷酸酶 或UidA基因（⑶S)，因为它具有多种已知的显色底物。
[0064] 那些经选择试剂处理后存活的植物细胞或者在筛选测定中被评分为阳性的细胞， 可以在再生培养基中培养并长成植物。在转移至温室或成熟生长箱之前，将正在生长的从 转化植物细胞再生的小植物转移到植物生长混合培养基中，使其硬化，例如在一个环境可 控的培养箱中，大约85%的相对湿度、600ppm CO2以及25-250微爱因斯坦m _2^的光照强 度。在转化子的鉴定后，植物的再生需要大约6周至10个月的时间，这取决于原始组织。植 物可以使用本领域技术人员熟知的常规植物育种方法时行受粉和种子生产，例如转基因玉 米常用自花受粉。再生的转化植物或其子代种子或植物需被鉴定重组DNA的表达并选择改 良农业性状。
[0065] 转基因植物和种子
[0066] 培育源自于本发明植物细胞的转基因植物，使其生长成为相对于对照植物具有改 良农业性状的转基因植物，并产生本发明所述转基因种子和单倍体花粉。这些具有改良农 业性状的植物是通过筛选转化植物或子代种子的改良性状而鉴定的。为了提高效率，应设 计一种选择方法以评估多个含有重组DNA的转基因植物（事件），比如从2-20的多个植物 或更多的转基因事件。此处提供的由传基因种子生长起来的传基因植物表现出更好的农业 性状，使得产量增加或由其它性状提升了植物的价值，包括如更好的种子质量。特别的好处 是植物具有提高的水利用率、增强的抗冻性、提高的产量、提高的氮利用率、改良的种子蛋 白和改良的种子油脂。
[0067] 表1提供了编码蛋白的DNA (基因）列表，可用这些基因作为重组DNA来产生具有 改良农业性状的转基因植物。表1的各要素通过以下进行：
[0068] "PEP SEQ"是从SEQ ID NO :5-8.中鉴定的一个氨基酸序列。
[0069] "NUC SEQ" 是从 SEQ ID NO : 1-4 中鉴定的一段 DNA 序列。
[0070] "基础载体"是一个基础质粒，用于重组DNA的转化。
[0071] "蛋白质名称"是指由重组DNA编码的蛋白质的通用名。
[0072] "质粒ID"指包含重组DNA的植物转化质粒的简称，该质粒的作用是在植物细胞中 表达重组DNA。
[0073] 表 1
[0074]
[0075] 具有改良农业性状的转基因植物的筛选方法
[0076] 许多转基因事件可以产生存活的可育的转基因植物，这些转基因植物可以产出种 子和子代植物，但不表现改良的农业性状。筛选是鉴定本发明的转基因植物所必需。通过 不同的测定改良性状的的检验方法对植物性状评估，可将具有改良农业性状的转基因植物 从其中所述转化植物种群中鉴定出来。这些检验可能会采用多种形式，包括但不仅限于分 析测定植物的化学成份、生物量、生理特征、形态学的变化。化学成份的变化如玉米营养成 份的变化能通过分析种子成份和蛋白、自由氨基酸、油脂、自由脂肪酸、淀粉或维生素 E含 量而被检测。生物量特征能因温室或大田的种植而改变，可包括植物的高、茎粗、根和枝条 的干重，以及对于玉米植物的穗长和直径。生理性质的改变可以由评估对压力条件的反应 来鉴定，例如在施加压力条件下，如缺水、缺氮、低温生长条件、病虫害、缺少光照或提高植 物密度，进行检验。形态学改变可以通过观察具有改良性状的转基因植物与正常植物比较 产生的可见变化趋势来进行测量，如比较分枝，较高、较厚、较窄的叶片，条纹叶片，结的性 状，萎黄，白化，花青素的产生或变化的雄花穗、穗或根。其它的筛选特征包括产生花粉的天 数、抽丝的天数、叶的扩展率、叶绿素的含量、叶片温度、林分、幼苗活力、结间长度、植物高 度、叶数、叶面积、分蘖、支柱根、滞绿、茎倒伏、根倒伏、植物健康度、不育/多产、生长打断 (green snap)和抗虫性。另外，可以评估收获谷粒的表型特征，包括穗上每排的米粒数、穗 上米粒的排数、米粒败育、米粒重量、米粒大小、米粒密度和谷粒的生理品质。
[0077] 本发明中对于具改良农业性状的转基因植物的优选种子是玉米和大豆植物，其它 的种子则是棉花、油菜、小麦、葵花、高粱、苜蓿、大麦、小米、水稻、烟草、水果和蔬菜作物，以 及草坪用草。
[0078] 提高的氮利用率的筛选
[0079] 本发明中的一个优选转基因植物的改良农业性状就是相对于对照植物具有提高 的氮利用率。高氮土壤的应用可以提高种子的蛋白和淀粉的积累，产生更大的种子重量和 每穗更多的谷粒数量。最近的在改良高产杂交玉米基因型上的进展包括了对氮的高效利 用。在农作物中产生提高的氮利用率的基因非常有用，例如，能提高产量。提高的氮利用率 可以用测定植物生长的改度来进行评估，比如测定植物生长在氮限制和/或氮充足条件下 的叶面积产量、枝的生物量、叶绿素含量。在氮限制条件下进行第一次筛选并在氮限制和氮 充足条件下确认复制的转基因事件是非常有用的。表2展示了用于氮利用率筛选的氮限制 条件（低氮生长条件）和氮充足条件（高氮生长环境）中所用的营养液中各营养成分的量。 例如在温室筛选盆中，分别在进行高氮和低氮选择种植后的8天和10天开始，将转基因植 物和对照植物用100mL的营养液处理，隔日一次，每周三次。
[0080] 表 2
[0081]
[0082] 注意：用HCl或KOH将pH调至5. 6
[0083] 对于低氮筛选在植物生长28天和对高氮筛选的23天后，进行如下方面测定：总枝 干的鲜重、叶片的叶绿素、叶片面积、叶片鲜重和叶片干重。
[0084] 对高产的筛选
[0085] 本发明的许多转基因植物相对于对照植物表现出提高的产量。高产可以是因为改 良的种子的库容量，即胚乳细胞或者米粒的数量和大小；和/或改良的库强度，即淀粉生物 合成的速率。库容量在米粒发育很早的时候就能建立，如胚乳细胞数量、细胞大小都在受粉 后的前几天就确定下来的。
[0086] 在过去几十年中，许多提高玉米产量的方法都是提高种植密度的结果。在这期间， 玉米产量以2. 1蒲式耳/英亩/年的速度提升，但种植密度则以250株/英亩/年的速度 增加。现代杂交玉米的一个特征就是这些品种能在高密度下种植。很多研宄已经显示出比 现在更高的种植密度的结果是更高的生物量的产出，但在这些更高的密度下现在的种