周让胚愈伤组织得 以发育。胚愈伤组织再被转移到含有l〇〇mg/L巴龙霉素的培养基中，间隔大概两周进行亚 培养。在初始筛选后6-8周可得到转化株。
[0125] 制备质粒载体克隆在表1中鉴定的DNA，以用于玉米的转化并且产生转基因玉米 植物和种子。
[0126] 对于玉米愈伤组织农杆菌介导的转化，未成熟胚需在切割后培养8-21天让愈伤 组织得以发育。将愈伤组织在室温下与农杆菌悬液共同孵育30分钟，然后吸干液体。在非 选择条件下将愈伤组织和农杆菌共培养3-6后，再用巴龙霉素选择培养大概6周，每两周转 入新鲜培养液，巴龙霉素抗性愈伤组织被鉴定为含有表达盒中的重组DNA。
[0127] 对于用微粒轰击的转化，未成熟玉米胚在轰击之前被分离出来并培养3-4天。进 行微粒轰击前，制备一种金颗粒悬液，并在上面沉淀期望的重组DNA表达盒。如美国专利 5, 550, 318和6, 399, 861所阐述，用放电粒子加速基因送递仪将DNA导入玉米细胞。在微粒 轰击之后，将组织于27°C下避光培养。
[0128] 为了产生转基因玉米植物，由转化产生的转基因愈伤组织被置于培养基上以开始 枝杆发育并形成小植物，将小植物转移到盆载土壤中在26°C培养室中进行初始培养，接着 进行"mist bench"，然后将之移植到5英寸盆中让植物生长成熟。让植物进行自花授粉，收 集产生的种子，用于种子、幼苗、子代R2植物或杂合体的筛选，例如上述的产量筛选试验。
[0129] 实施例3
[0130] 该实施例进一步说明对具有改良农业性状，即相对于对照植物来说提高的氮利用 率、高产、提高的水利用率、改良的耐冻性和/或改良的种子成份，的转基因玉米种子的生 产和鉴定。通过转化，制备了含有重组DNA的转基因玉米种子和植物，该重组DNA来自于克 隆在如表1中所鉴定的基础载体之一中的各个基因。许多转基因事件虽然可产生存活的可 育转基因植物并能产生种子和子代植物，但却不能显现出改良的农业性状。具有本发明所 述改良农业性状的转基因植物和种子通过筛选其氮利用率、产量、水利用率和抗冻性而被 鉴定出来。具有改良种子成分的供种转基因植物通过分析种子的成分包括蛋白、油脂和淀 粉含量而被鉴定出来。
[0131] A.提高的氮利用率
[0132] 本发明提供的具有提高的氮利用率的转基因植物是通过按照上述的标准程序的 筛选过程而筛选出来的，以下表8显示了这些转基因植物的性能。
[0133]
[0134] 产量
[0135] 本发明提供的具有改良产量的转基因植物是通过按照上述的标准程序的筛选过 程而筛选出来的，以下表9和表10显示了这些转基因植物的性能，在表示玉米产量的变化 上是用蒲式耳/英亩为单位的。
[0136]表 9
[0140] 水利用率
[0141] 本发明提供的具有改良水利用率的转基因植物是通过按照上述的标准程序的筛 选过程而筛选出来的，以下表11显示了这些转基因植物的性能。
[0142] 表 11
[0143]
[0144] 抗冻性
[0145] 本发明提供的具有改良抗冻性的转基因植物是通过按照上述的标准程序的筛选 过程而筛选出来的，以下表12显示了这些转基因植物早期幼苗的生长性能。
[0146]
[0147]
[0148] 改良的种子组成
[0149] 本发明提供的具有改良种子组成的转基因植物是通过按照上述的标准程序的筛 选过程而筛选出来的，以下表13-5显示了这些转基因植物的性能。
[0150] 表14油脂
[0151]
[0152] 表15蛋白质
[0153]
[0154] 实施例4
[0155] 该实施例阐明了具有通过组合的改良性状的转基因植物。如实施例3中所述，通 过引入来自于表1所鉴定的各个基因的重组DNA，产生具有各种改良农业性状的转基因植 物。为了将这些转基因植物农业性状进一步改良，将表1中的基因与一个或多个能够改良 农业性状的其它基因进行组合，以产生相对于单独使用其中一个基因，在一个或多个农业 性状上具有更高改良的转基因植物。达到这种组合形式，可以通过转化的方法也可以使用 育种的方法。以下的例子可说明这种原理。一种转基因玉米植物由质粒PM0N74923稳定转 化，该质粒含有由玉米醛缩酶（FDA)启动子（美国专利申请No. 09/757, 089)控制的玉米植 物色素 B(phyB)基因（SEQIDN0:15)，将该玉米植物与由pM0N68392稳定转化的转基因玉 米植物杂交。相对于只含PhyB基因的玉米植物提高的产量（2.4%)，杂交品种提高的产量 (bu. /a)达到 7. 2%。
[0156] 实施例5.大豆植物的转化
[0157] 该实施例说明了用于生产本发明所述转基因大豆上的植物转化，以及用于产生具 有改良农业性状的转基因大豆的转基因种子的生产和鉴定，即相对于对照植物具有的提高 的氮利用率、提高的产量、改良水利用率、在寒冷压力下改良的生长力和/或改良的种子油 月旨、蛋白和/或淀粉含量。对于农杆菌介导的转化，让大豆种子萌发过夜，切下分生组织外 植块。将分生组织和外植块放进一个创伤管里。将大豆外植块和包含质粒DNA的农杆菌株 诱导细胞混合在一起，该质粒DNA带有目的表达盒的基因和一个植物选择性标记盒，整个 过程从种子萌发起始到声裂创伤时间不超过14个小时。在创伤处理之后，将外植块共同培 养2-5天，然后将它们转移到选择培养基中培养6-8周让转基因枝杆得以选择和生长。性状 阳性枝杆在大约在轰击后6-8周时收集，并放于选择性生根培养基中2-3周。长出根的枝 杆被转移到温室，在土壤中盆栽。在选择培养时保持健康但不生根的枝杆被转移至非选择 性生根培养基中继续培养两周。在所有选择结束后生根的枝杆移植于温室土壤盆载之前， 测定这些枝杆的根是否有植物选择性标记表达。
[0158] 实施例6
[0159] 该实施例进一步阐述了用于产生具有改良农业性状的转基因大豆的转基因种子 的生产和鉴定，这些改良的性状即是相对于对照植物所具有的提高的氮利用率、提高的产 量、改良水利用率、在寒冷压力下改良的生长力和/或改良的种子成份。通过转化制备了包 含重组DNA转基因大豆种子和植物，该重组DNA来自于克隆在如表1中所鉴定的基础载体 之一中的各个基因。许多转基因事件虽然可产生存活的可育转基因植物并能产生种子和子 代植物，但却不能显现出改良的农业性状。具有本发明所述改良的农业性状转基因植物和 种子通过筛选其氮利用率、产量、水利用率和抗冻性而鉴定出来。具有改良种子成分的供种 转基因植物通过分析种子的成分包括蛋白、油脂和淀粉含量而被鉴定出来。
【主权项】
1. 一种用于产生非天然的转基因玉米种子的方法，所述种子用于产生表现出由稳定整 合的重组DNA赋予的提高产量的转基因玉米植物作物，该重组DNA包含在植物细胞中有功 能的启动子，该启动子可操纵地连接到编码与SEQIDNO: 5具有至少80% -致性的蛋白质 的DNA序列，所述方法包括： (a) 获得包含所述稳定整合的重组DNA的玉米植物种群； (b) 从所述种群中选择出一个或多个植物，所述植物包含所述稳定整合的重组DNA并 且与不含所述重组DNA的对照植物相比表现出提高产量；和 (c) 收集所选择植物的种子。2. 权利要求1的方法，其中所述提高产量是与不含所述重组DNA的对照植物相比至少 〇. 51每英亩的蒲式耳数的提高产量。3. 权利要求1的方法，其中所述DNA序列编码与SEQIDNO: 5具有至少90% -致性的 蛋白质。4. 权利要求1的方法，其中所述种群中的植物还包含编码以下蛋白的DNA:所述蛋白提 供忍耐以对野生型植物细胞致死水平施加的除草剂处理的耐受性。5. 权利要求4的方法，其中所述除草剂包括草甘膦、麦草畏或草铵膦化合物。6. -种用于产生杂合玉米种子的方法，所述杂合玉米种子可用于产生表现出提高产量 的玉米植物，所述方法包括： (a) 获得权利要求1方法的种子； (b) 从所述玉米种子中产生具有提高产量的玉米植物；和 (c) 将所述玉米植物与第二玉米植物杂交以产生杂合种子。7. 权利要求6的方法，其中所述提高产量是与不含所述重组DNA的对照植物相比至少 〇. 51每英亩的蒲式耳数的提高产量。8. 权利要求6的方法，其中所述DNA序列编码与SEQIDNO: 5具有至少90% -致性的 蛋白质。9. 权利要求1或6的方法，其中所述选择通过以下方式进行：使用免疫反应性抗体来 检测种子或植物组织中所述蛋白的存在。10. 将提高产量赋予玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的细胞中表达重 组DNA，所述重组DNA包含在植物细胞中有功能的启动子，该启动子可操纵地连接到编码与 SEQIDNO: 5具有至少80% -致性的蛋白质的DNA序列。11. 权利要求10的方法，其中所述提高产量是与不含所述重组DNA的对照植物相比至 少0. 51每英亩的蒲式耳数的提高产量。12. 权利要求10的方法，其中所述DNA序列编码与SEQIDNO: 5具有至少90% -致性 的蛋白质。13. 具有稳定整合的重组DNA的玉米植物细胞，所述重组DNA包含在植物细胞中有功 能的启动子，该启动子可操纵地连接到编码与SEQIDNO: 5具有至少80% -致性的蛋白质 的DNA序列，其中包含所述玉米植物细胞的玉米植物与不含所述重组DNA的对照植物相比 表现出提高产量。14. 权利要求13的玉米植物细胞，其中所述提高产量是与不含所述重组DNA的对照植 物相比至少0. 51每英亩的蒲式耳数的提高产量。15. 权利要求13的玉米植物细胞，其中所述DNA序列编码与SEQIDNO: 5具有至少 90%-致性的蛋白质。16. 权利要求13的玉米植物细胞，其中所述玉米植物细胞还包含能够表达以下蛋白质 的DNA:所述蛋白质提供忍耐以对野生型植物细胞致死水平施加的除草剂处理的耐受性。17. 权利要求16的玉米植物细胞，其中所述除草剂包括草甘膦、麦草畏或草铵膦化合 物。
【专利摘要】本公开描述了一种从用重组DNA转化以表达具有同源结构域蛋白的植物细胞中筛选出一定数量转基因植物的方法，以鉴定已转入用于表达改良性状的特定基因的转基因农业植物。这些性状包括增加氮的利用率、提高产量、增加水的利用率、增强对冷负荷的耐受力和/或改良种子成分。同时也公开了转基因种子，这些种子能生长成为在基因组中带有重组DNA并表现出所筛选的增强性状的转基因植物。还公开了基于转基因事件的产生种子和植物的方法。
【IPC分类】C12N5/10, A01H5/10, C12N15/82
【公开号】CN104894160
【申请号】CN201510303613
【发明人】A.伦德
【申请人】孟山都技术有限公司
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2005年12月19日
【公告号】CA2594228A1, CN101384167A, CN101442902A, CN101442902B, EP1827078A2, EP1827078A4, EP1827078B1, US8895818, US20060179511, US20150047069, WO2006069017A2, WO2006069017A3