质则 没能有好的表现。一个提高产量的途径就是在高密度种植时提高收获指数（HI)，即相对于 总生物量米粒分配到的生物量占的比例。
[0087] 对转基因玉米产量的有效筛选利用转基因事件杂交子代在最优的生产管理以及 最好害虫控制下于多个地点进行种植。对于高产有用的指标是相对于种植对照植物的种子 在产量上有5%到10%的提升。有效的筛选需在多个不同的地理位置，如多至16或更多的 地点，和多于一个或多个种植季节，如至少两个种植季节进行，以从统计学上区别产量提升 和自然环境的影响。要种植多种转基因植物、阳性和阴性对照植物和传粉植物，将它们种植 于标准样地中，例如，两排样地，20英尺长，5英尺宽，每排间隔30英寸，行列之间有3英尺 的小径。转基因事件由重组DNA的结构进行分组，各组随机播种于地中。在使用雄性不育转 基因事性时，每两个样地间需种植一个样地的高品质玉米种系传粉者以进行自由传粉。有 效的种植密度为大约30000个植物/英亩。
[0088] 用于产量提高筛选的替代指标包括源容量（生物量）、源产出（蔗糖和光合作 用）、库组成（米粒大小、穗大小、种子中的淀粉）、发育（光反应、高度、密度耐受性）、成熟、 早期开花性状和对高密度种植的生理反应，例如每英亩45000个植物的种植密度，如表3和 表4所展示。
[0089] 表 3
[0090]
[0091] 当对产量提高进行筛选时，一个有效的统计学检测途径包括三个组成部分，即分 别对分布各个区域实验地建立空间自相关模型，对针对各区域的空间依赖性进行重组DNA 事件的性状校正，和进行交叉地域分析。建立空间自相关模型的第一步是估计半变异函数 的协方差参数。假定用一个球体协方差模型来建立空间自相关模型。因为实验的大小和性 质，空间自相关可能会改变。所以需与球体协方差同时假定各向异性。以下的一套方程式 描述了各向异性球状协方差模型。
[0094] 和
[0095] X = [cos(/7^·/180)(x, -x2)~ sin(ρπ/180)0/j -)]/ωχ
[0096] ^ = ^111(^^/180)(?:, -x^ + cos^/lSOX,)；,-y2)]lay
[0097] 其中SI = (xl，yl)是一个区域的空间坐标，S2是第二个区域的空间坐标。有5 个协方差参数。
[0098] Θ = (v，σ 2，p，ωη，ω j)
[0099] 其中v是硬块效应，σ 2是偏坎（partial sill)，P是从北顺时旋转度数，ω 11是 短轴的定标参数，Qi是相等协方差的各向异性椭圆的长轴定标参数。使用来自大量复制授 粉器曲线经由最大限制性似然途径的数据来估计定义空间趋势的五个协方差参数。在多区 域田地试验中，对每个区域要分别进行空间趋势建模。
[0100] 在获得模型不同参数后，要对准备分析的数据建立变异数协方差结构。该变异数 协方差结构包括用于校正空间依赖性产量数据的空间信息。在这种情况下，一个最能表现 该研宄处理和实验设计的嵌套模型将与变异数协方差结构一起用于对产量数据的校正。在 这个过程中，苗圃或种子批次影响也能建模并被评估以校正对任何由于种子批间不同所引 起的产量差异。
[0101] 在对来自于不同区域的数据进行空间校正之后，所有的被校正数据将在假设区域 重复条件下被合并分析。在该分析中，区域内或区域间的变量被结合起来以估算转基因植 物和对照植物产量的标准差。相对平均比较用于显示有统计学意义的产量提高。
[0102] 对水利用率的筛诜
[0103] 本发明使得转基因植物具有高产量的一个方面是因为提高的水利用率和/或抗 旱性。在这个例子中所述是一种对于转基因玉米植物相对于野生型玉米植物（用作测试的 为近交系或杂合系）水利用率的高通量温室筛选方法。这个筛选过程在植物11天的初始 压力自由生长后在共15天期间加上了三个干旱/再供水循环。每5天一个循环，每个循环 前4天不供水，第5天进行水淬。由该筛选方法主要分析的基因型是那些在保证营养的干 旱处理期间植物生长率发生改变的植物，这个生长率由植物高度和生物量所决定。枝条的 水合状态干旱处理后被测定。在三个时间点测定植物的高度。第一个时间点在植物11天 大时开始干旱处理之前取得，这时为枝杆的初始早度（SIH)。植物高度也会在干旱/再供 水法的中途，种植后的18天被测量，以获得枝杆的中期干旱高度（SMH)。在最后一个干旱 循环完成时，即种植后的26天，收获植物的枝杆部分，并测量最终高度，即枝杆的萎蔫高度 (SWH)，同时也测定枝杆的萎蔫生物量（SWM)。将枝杆置于40摄氏度水中，避光。三天后，称 量枝杆重量即为枝杆吸胀重量（STM)。用烘箱干燥4天后，称量枝杆重量即为枝杆干燥生物 量（SDM)。枝杆均高（SAH)是三次高度测定后的植物平均高度。上述阐述的过程可以根据 条件在每步上调整+/_ -天。
[0104] 为了校正植物之间的轻度差别，从SIH和SWH中衍生出一个大小校正生长值。 这就是相对生长率（RGR)。每个枝条的相对生长率可依照公式[RGR%= (SWH-SIH)/ ((SWH+SIH)/2)*100]进行计算。相对水含量（RWC)是对收获时水在植物中所占比例（％ )。 每个枝条相对水含量（RWC)可依照公式[RWC%= (SWM-SDM) ASTM-SDM)*100]进行计算。 完全供水的玉米植物其中年龄的RWC约为98%。
[0105] 对在寒冷压力下牛长的筛选
[0106] 本发明一个方面提供了在寒冷压力下具有改良生长状况的转基因植物，例如在早 期幼苗生长测定中，测定了 3批种子。第一批是一组是从转基因植物收获的转基因种子；第 二批是转基因种子的阴性分离子；第三批是从两种抗冻和两种不抗冻的野生型对照植物获 得的种子。所有的种子均用以上提及的杀霉剂处理。将种子种于萌发纸上（12英寸X 18英 寸Anchor Paper#SD7606)，用0· 5%謂03和0· 1% Thyram溶液湿润。在每片纸上将15粒 种子沿直线平均放置，以使根向同一边缘生长。将湿纸均匀卷紧，以保持种子的位置。把纸 卷小心地放入有两个大纸夹的地方，一个夹在顶部，一个夹中底部。将纸卷按完全随机组设 计装入合适的容器，在温度为23°C的培养室中孵育三天。培养室的湿度设置为65%，无光 照循环。对进行寒冷压力处理组，将纸卷在12°C培养室中孵育14天，培养室的湿度设置为 65%，无光照循环。对进行热处理组，将纸卷在23°C多孵育两天。将处理后的萌发纸打开， 弃去未发芽的种子。测量每粒种子的胚根与胚芽鞘长度。从每组六个单独米粒收集胚芽鞘 样本以确定重组DNA的表达。用经过前处理和冷处理后的根和苗在长度上的统计学差异来 评估寒冷处理在玉米植物上的影响。分别单独对热和冷处理组进行分析。
[0107] 对棺物种子中改自的油脂、淀粉或蛋白含量的筛诜
[0108] 植物种子中的油脂含量由低分辨率sup 1H核磁共振（NMR)来确定（Tiwari等， JA0CS，51 :104-109(1974);或 Rubel，JA0CS，71 :1057-1062(1994))。也可用近红处光谱 (NIR)来确定油脂、淀粉和蛋白的含量。
[0109] 以下实施例用于说明本发明。
[0110] 实施例1
[0111] 该实施例说明用于转运重组DNA进入植物细胞的质粒的构建，而该植物细胞可以 再生成为本发明所述转基因植物。用于PCR扩增重组DNA蛋白编码核苷酸的引物被设计在 或靠近编码序列的起始和中止密码子处，以清去大部分的5'和3'的非翻译区。在插入基础 载体之前，如表1中引用，每一个编码表1中所鉴定蛋白的重组DNA都将用PCR进行扩增。
[0112] 使用GATEWAY(TM)Destination植物表达载体系统（由Invitrogen生命科技 Carlsbad，CA提供）构建一种基础植物转化载体pM0N65154用于重组DNA转化进入玉米组 织。参考表5下部所述元件和SEQ ID N0:9，pM0N65154包括了一个可选的标记表达盒和一 个模板重组DNA表达盒。标记表达盒包括了一个CaMV 35S启动子，连接在新霉素磷酸转移 酶II (riptll)编码基因上，后面再接着一个根癌农杆菌胆脂碱合成酶（nos)基因。模板重 组DNA表达盒与标记表达盒尾尾相对。模板重组DNA表达盒包含了 5'调控DNA，包括水稻 肌动蛋白1的启动子、外显子和内含子，接着是一个GATEWAY?重组DNA插入位点，然后是土 豆蛋白酶抑制物II (PinII)基因的3'区域。在重组DNA被插入进插入位点后，该质粒就能 用于植物转化，比如使用微粒轰击法。
[0113] 表 5
[0114]
[0115] 相似的载体质粒pM0N72472(SEQ ID NO :10)也被构建起来用于农杆菌介导的植物 转化方法，该质粒与PM0N65154相似，除了（a)在模板重组DNA表达盒中的5'调节DNA是 一个水稻肌动蛋白启动子和一个水稻肌动蛋白内含子，（b)加入了来自于农杆菌T-DNA左 右边缘序列，其中右边缘序列加在水稻肌动蛋白1启动子的5'端，而左边缘序列则位于35S 启动子的3'端；(c)加入DNA以使质粒在大肠杆菌和根癌农杆菌中均容易复制。该DNA加 在质粒T-DNA边缘序列之外，包括了一个在农杆菌中有效的orN宽宿主范围DNA复制起点 和在大肠杆菌中有效的PBR322复制起点，以及一个同时能用于大肠杆菌和农杆菌选择的 大观霉素/链霉素抗性基因。PM0N74775由一个与pM0N72472基本相同的基础质粒所构建。 [one] 其它与上述相似的基础质粒也被构建出来，包括含有丙酮酸磷酸二激酶（ProK) 启动子（SEQ ID NO :11)和作为增强子的玉米DnaK内含子（SEQ ID NO :12)的pM0N81244。
[0117] 用于大豆转化的棺物表汰裁体
[0118] 用于大豆转化的质粒也已被制备出来。可作范例的通用表达载体质粒 pM0N74532(SEQ ID N0:13)的各组件都在表7下展示。
[0119] 构建类似于上述的用于大豆转化的质粒载体以用于农杆菌（Agrobacterium)介 导的大豆转化，PM0N74537,其含有Arabidopsis thaliana核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶 (Rubisco)小亚单位启动子（SEQ ID NO :14)。
[0120] 在插入位点插入载体之前，通过PCR来扩增编码重组DNA片段的蛋白。在或接近 起始密码子和终止密码子设计用于PCR扩增的引物，以消除大部分5'和3'未翻译区域。
[0121] 表 7
[0122]
[0123] 实施例2
[0124] 该实施例说明植物转化在产生本发明的转基因玉米植物上很有作用。将一种易转 化的玉米植物种植于温室之中，当胚长到1. 5到2. Omm长时，收获其穗。通过喷撒或将穗浸 泡入80%乙醇来对穗表面消毒，然后风干。在表面消毒的穗上的各个米粒中分离出未成熟 胚。在接种玉米细胞之前，将农杆菌细胞在室温培养过夜。将切下来的未成熟的玉米胚立 即与农杆菌在一起，并与农杆菌在室温共同孵育5-20分钟。把未成熟胚与农杆菌在23°C避 光共同培养1-3天。共培养后的胚被转移至选择培养基中并培养大约两