后，得到分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀的分散溶液。
[0026](3)向分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀中加入0.05mol/L的EDTA溶液10ml，4°C下震荡反应lh，于3000rpm离心洗涤lOmin，反复洗涤3次，以彻底去除CaCO3模板，经真空冷冻干燥，获得多孔固定化脂肪酶微球。
[0027]经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活为90.2%。回收多孔固定化脂肪酶微球，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活仍保留80.3%。
[0028](4)对照试验
[0029]将质量比为5:1游离态米黑根毛霉脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于pH=5.8，摩尔浓度为0.lmol/L的20mL磷酸盐缓冲液中，制成10mg/mL酶液。取50mL酶液，滴加150mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4?25°C下缓慢震荡I?2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min，将获得的沉淀再悬浮于磷酸盐缓冲液中，向其中缓慢滴加5%的戊二醛溶液10ml，并轻微搅拌，交联120min，3000rpm离心5min，弃去上清液，经磷酸盐缓冲液洗涤数3次，得到交联脂肪酶聚集体，经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，交联脂肪酶聚集体的相对酶活为70.2%。回收交联脂肪酶聚集体，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，交联脂肪酶聚集体的相对酶活保留为30.5%。
[0030]实施例2
[0031](I)将质量比为6:1游离态南极假丝酵母脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH = 7，摩尔浓度为0.2mol/L磷酸盐缓冲液中，制成llmg/mL酶液。取50mL酶液，加入0.4mol/L氯化钙水溶液lOOmL，混合均匀后，快速加入等量的等摩尔浓度碳酸钠溶液lOOmL，在4?25°C温度条件下磁力搅拌lmin，静置2h，通过共沉淀让游离态酶分子均匀分散于CaC0#j粒模板剂内部，形成稳定的球形模板化碳酸钙颗粒；再滴加ISOmL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4?25°C下缓慢震荡I?2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min得共沉淀颗粒；
[0032](2)向共沉淀颗粒中加入50mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)溶液lml，4°C下缓慢震荡lmin，静置30min后，3000rpm离心洗涤3min，去除二硫苏糖醇(DTT)，将离心获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2?3h后，得到分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀的分散溶液。
[0033](3)向分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀中加入0.05mol/L的EDTA溶液12ml，4°C下震荡反应lh，于3000rpm离心洗涤lOmin，反复洗涤3次，以彻底去除CaCO3模板，经真空冷冻干燥，获得多孔固定化脂肪酶微球。
[0034]经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活为96.7%。回收多孔固定化脂肪酶微球，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活仍保留83.3%。
[0035](4)对照试验
[0036]将质量比为6:1游离态南极假丝酵母脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH = 7，摩尔浓度为0.2mol/L磷酸盐缓冲液中，制成llmg/mL酶液。取50mL酶液，滴加ISOmL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4?25°C下缓慢震荡I?2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min，将获得的沉淀再悬浮于磷酸盐缓冲液中，向其中缓慢滴加5%的戊二醛溶液10ml，并轻微搅拌，交联120min，3000rpm离心5min，弃去上清液，经磷酸盐缓冲液洗涤数3次，得到交联脂肪酶聚集体，经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，交联脂肪酶聚集体的相对酶活为72%。回收交联脂肪酶聚集体，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，交联脂肪酶聚集体的相对酶活保留为36.5% ο
[0037]实施例3
[0038](I)将质量比为10:1游离态扩展青霉脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH = 8，摩尔浓度为lmol/L磷酸盐缓冲液中，制成15mg/mL酶液。取50mL酶液，加入0.5mol/L氯化钙水溶液100mL，混合均匀后，快速加入等量的等摩尔浓度碳酸钠溶液100mL，在4?25°C温度条件下磁力搅拌lmin，静置2h，通过共沉淀让游离态酶分子均匀分散于CaCO#^粒模板剂内部，形成稳定的球形模板化碳酸钙颗粒；再滴加200mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4?25°C下缓慢震荡I?2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min得共沉淀颗粒；
[0039](2)向共沉淀颗粒中加入50mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)溶液1.2ml，4°C下缓慢震荡lmin，静置30min后，3000rpm离心洗涤3min，去除二硫苏糖醇(DTT)，将离心获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2?3h后，得到分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀的分散溶液。
[0040](3)向分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀中加入0.lmol/L的EDTA溶液10ml，4°C下震荡反应lh，于3000rpm离心洗涤lOmin，反复洗涤3次，以彻底去除CaCO3模板，经真空冷冻干燥，获得多孔固定化脂肪酶微球。
[0041]经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活为92.6%。回收多孔固定化脂肪酶微球，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，多孔固定化脂肪酶微球的相对酶活仍保留81.7%。
[0042](4)对照试验
[0043]将质量比为10:1游离态扩展青霉脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH=8，摩尔浓度为lmol/L磷酸盐缓冲液中，制成15mg/mL酶液。取50mL酶液，滴加200mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4?25°C下缓慢震荡I?2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min，将获得的沉淀再悬浮于磷酸盐缓冲液中，向其中缓慢滴加5%的戊二醛溶液10ml，并轻微搅拌，交联120min，3000r/min离心5min，弃去上清液，经磷酸盐缓冲液洗涤数3次，得到交联脂肪酶聚集体，经国标(GB/T23535-2009)中橄榄油乳化法检测，交联脂肪酶聚集体的相对酶活为84%。回收交联脂肪酶聚集体，用蒸馏水洗涤三次后，重新加入底物进入下一轮反应，如此重复测定10次以后，交联脂肪酶聚集体的相对酶活保留为40.6% ο
[0044]实施例4
[0045](I)将质量比为8:1柱状假丝酵母脂肪酶和牛血清白蛋白(BSA)保护剂溶于于pH=7，摩尔浓度为0.8mol/L磷酸盐缓冲液中，制成15mg/mL酶液。取50mL酶液，加入0.5mol/I氯化钙水溶液100mL，混合均匀后，快速加入等量的等摩尔浓度碳酸钠溶液100mL，在4?25°C温度条件下磁力搅拌lmin，静置2h，通过共沉淀让游离态酶分子均匀分散于CaCO#^粒模板剂内部，形成稳定的球形模板化碳酸钙颗粒；再滴加200mL饱和硫酸铵溶液沉淀剂，在4?25°C下缓慢震荡I?2min后，静置2h，进行脂肪酶凝聚沉淀，3000rpm离心洗涤3min得共沉淀颗粒；
[0046](2)向共沉淀颗粒中加入50mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)溶液1.5ml，4°C下缓慢震荡lmin，静置45min后，3000rpm离心洗涤3min，去除二硫苏糖醇(DTT)，将离心获得的沉淀物重新用磷酸盐缓冲液悬浮分散，静置2?3h后，得到分子间交联自组装固定化酶微粒沉淀的分散溶液。
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