多肽、包含该多肽的检测器件和包含该器件的检测试剂盒的制作方法_2

文档序号:9229737阅读:来源:国知局
>[0038] 具有亲水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的细菌细胞、核酸以及其它成分。作为 该磁珠的例子,可以列举出Polysciences,Warrington,PA销售的珠子(名称:Biomag (注 册商标)羧基)、或者 Bangs Laboratory,Inc.,Fishers,IN 的名称为 MC02N/2928 的珠子。 或者,可以使用Dynal Biotech销售的M-270等。
[0039] 在本发明的一个优选实施方式中,所述固体载体是SJ改性硅胶,其是苏州傯聚生 物材料有限公司开发的一种硅橡胶材质的微阵列固体支撑材料(iPDMS薄膜,参见中国专 利公开CN101265329A)。这种材料是以生物学研宄常用的PDMS为基础,在其中加入特定的 引发剂成分(使该材料可通过表面引发聚合反应(SIP)实现表面功能化修饰),再经过聚乙 二醇甲基丙稀酸醋(p〇ly(〇lig〇(ethylene glycol)methacrylate),pOEGMA)表面修饰获得 的。SJ改性硅胶具有优秀的抗蛋白质非特异性吸附(Nonspecific protein adsorption, NPA)能力,可以将复杂蛋白免疫检测中的非特异性蛋白质吸附控制到接近"绝对0"水平 (接近或低于仪器的检测极限),不仅可以免除封闭和多次清洗的麻烦,还可以通过使用更 强的信号扩增手段来提高蛋白质微阵列的灵敏性。而且其硅橡胶的本质赋予了该材料较强 的机械性能和良好的可操作性。苏州傯聚已经成功地将SJ改性硅胶应用于11个肿瘤标志 物组成的多指标联检微阵列ELISA试剂盒,实现了高通量和高灵敏的检测,证明了这种材 料是一种优秀的蛋白质微阵列固体支撑材料。同时,这种材料还具有表面性质可调的特性, 可以通过控制修饰反应时间在一定范围内调整其表面形貌。
[0040] 本发明的多肽与固体载体的连接可以采用本领域技术人员公知的多肽与固体载 体的连接方法来进行。例如,对于蛋白质/多肽与改性硅胶表面的连接而言,可以通过 I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺[l-ethyl-3-(3_dimethyl ami-nopropyl) carbodiimide,EDC]和 N-羟基瑭泊酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)的反应将改 性硅胶表面高分子链上的羧基(-C00H)基团改为活化基团,该活化基团可与蛋白/多 肽上所带的氨基(-NH2)反应从而实现将蛋白/多肽固定于固体载体表面(参见例如 Hongwei Ma,Yuanzi ffu, Xiaoli Yang1Xing Liu, Jian, an He, Long Fu, Jie Wang, Hongke Xu, Yi Shi and Renqian Zhong, Integrated poly (dimethysiloxane)with an intrinsic nonfouling property approaching" Absolute''zero background in immunoassays, Anal. Chem.,82, 6338 - 6342, 2010)。
[0041] 对于点样时使用的点样液中本发明的多肽的浓度没有特殊限制,本领域技术人员 可以依常规选择,优选为1 μ g~1000 μ g/mL,更优选10 μ g~500 μ g/mL。此外,对于本发 明的多肽在固体载体上分布的密度没有特殊限制,本领域技术人员可以依常规选择,优选 为1~100点/10mm2,更优选5~50点/10mm2〇
[0042] 本发明的检测器件对于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断是有用的,或者其 可以用于制造可用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断的检测试剂盒。
[0043] 本发_的检测试齐I丨盒
[0044] 在另一个方面中,本发明还提供一种检测试剂盒(本发明的检测试剂盒),其包括 本发明的检测器件。该检测试剂盒可用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断。
[0045] 本发明的检测试剂盒必须包含本发明的检测器件。本发明的检测试剂盒还可以包 括:
[0046] 1.配好的血清样本稀释液或血清样本稀释液组分溶液:样本稀释液,例如有北京 赛驰生物科技有限公司的样本稀释液(产品编号070021-S2)、郑州博威嘉生物科技有限公 司的加样变色样本稀释液(产品编号bwj010103)等。该类样本稀释液为含BSA、蔗糖等成 分的PBS溶液,含防腐剂,澄清液体,可直接使用。该样本稀释液用来稀释血清,试剂盒检测 的血清要稀释适当倍数,例如2~200倍,优选10~100倍。
[0047] 本发明的检测试剂盒还可以包括:
[0048] 2.浓缩洗液及洗液:固体载体表面孵育血清及酶标二抗后,需用洗液清洗掉固体 载体表面未结合的抗体和酶标二抗。浓缩洗液例如是1 %的吐温20水溶液,使用时需稀释 2~40倍、优选5~20倍。可以通过将浓缩洗液(10X)用纯化水或蒸馏水按1:9稀释,来 配置洗液。例如,450mL纯化水或蒸馏水中加入50mL浓缩洗液(10X),充分混匀。未使用 完的洗液放在2~8°C保存,可保存3个月。
[0049] 本发明的检测试剂盒还可以包括:
[0050] 3.酶标二抗溶液:人肠道病毒71型感染者血清中的IgG可与固体载体(例如SJ 改性硅胶)上的本发明的多肽结合,酶标二抗可与抗体结合,而酶标二抗上的标记物可与 发光底物混合溶液反应,从而发出可检测的光。酶标二抗可以是例如辣根过氧化物酶标 记的羊抗人IgG。对酶标二抗在酶标二抗溶液中的浓度没有特殊限制,可以是例如Ing~ 1000ng/mL 〇
[0051] 本发明的检测试剂盒还可以包括:
[0052] 4.发光底物混合溶液:发光底物混合溶液可与酶标二抗上标记的辣根过氧化物 酶反应,使得反应发出仪器可检测到的化学光,发光底物混合溶液包括发光底物液A-过氧 化氢溶液,及发光底物液B-发光氨(鲁米诺)溶液。使用时预先采用两种发光底物液体以 等体积混合而成,得到发光底物混合溶液(45分钟内使用)。发光氨只有用氧化剂处理过才 会发光。通常使用双氧水和一种氢氧化物碱的混合水溶液作为激发剂。在辣根过氧化物酶 催化下,双氧水分解为氧气和水:
[0053] 2H2〇2- O 2+2H20
[0054] 鲁米诺与氢氧化物反应时生成了 一个双负离子,它可被过氧化氢分解出的氧气氧 化,产物为一个有机过氧化物。该过氧化物很不稳定,立即分解出氮气,生成激发态的3-氨 基邻苯二甲酸。激发态至基态转化中,释放的能量以光子的形式存在,波长位于可见光的蓝 光部分。发光底物混合溶液的例子例如Thermo Seientific公司的Supei'Signal? ELISA Femto Maximum Sensitivi-ty Substrate,货号 37074。
[0055] 本发明的检测试剂盒还可以包括:
[0056] 5. -个或两个以上的反应腔体,根据需求可以采用例如双面的生物孵育反应 器,中国专利ZL 201120177686. 3或者ZL201110142518. 5 ;或者单面的生物孵育反应器 ZL201220430886. X。
[0057] 本发明的检测试剂盒还可以包括:
[0058] 6.其他用于检测肠道病毒71型的检测分子(例如多肽、蛋白质、核酸等)。
[0059] 本发明的检测试剂盒还可以包括:
[0060] 7.使用说明书,其中记载了该检测试剂盒可以用于肠道病毒71型抗体IgG的临床 辅助诊断。
[0061] 反应器件和反应试剂盒可以例如采用凝胶成像仪进行化学发光成像。作为凝胶成 像仪,可以采用例如GE LAS4000mini型或天能5500型微阵列成像仪。 实施例
[0062] 以下,通过实施例对本发明进行更具体的说明,但并不是对本发明技术范围的限 定。通过本说明书的记载,本领域技术人员可以容易的对本发明进行修饰/改变,这些包含 在本发明的技术范围内。本发明的范围由权利要求书确定。
[0063] 1.多肽制备与确认
[0064] 实施例中使用的多肽具有SEQ
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