进行了解淀粉芽孢杆菌)(K-2对西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根 腐病菌拮抗作用的测试。
[0045] 将筛选出的抑菌作用最明显的菌株ΧΚ-2接入LB液体培养基中，于28°C下130r/ min振荡培养24-28h，制成菌悬液。在不同PDA平板中心分别接入西瓜枯萎病菌、水稻纹枯 病菌、核桃根腐病菌等病原真菌，用移液器将Hi-2菌悬液呈三角状对称接入PDA平板，每点 接入10 μ L，距离中心约2cm，以无菌水为对照，28°C培养观察对峙培养抑菌情况，4d后测量 菌落半径，解淀粉芽孢杆菌Hi-2对西瓜枯萎病菌的抑菌情况见附图2、对水稻纹枯病菌的 抑菌情况见附图3、对核桃根腐病菌的抑菌情况见附图4。
[0046] 采用以下公式计算菌株XK-2对病原真菌生长的相对抑菌率，每处理重复三次。
[0047] 相对抑制率=(对照菌落半径-处理菌落半径）/对照菌落半径X 100%
[0048] 解淀粉芽孢杆菌)(K-2对西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌等几种重要 土传病原真菌均具有明显的拮抗作用，结果见表1，其相对抑制率分别为80. 8%、81. 6%、 75. 0%。通过镜检观察解淀粉芽孢杆菌ΧΚ-2对西瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用，见附图 5,发现菌株ΧΚ-2处理的菌丝生长缓慢，末端细小，扭曲，崩溃等畸形症状，而对照菌丝生长 均匀。
[0049] 表1 :解淀粉芽孢杆菌)(Κ-2对几种不同病原真菌的拮抗作用
[0051 ] 二、解淀粉芽孢杆菌ΧΚ-2菌剂的制备
[0052] 按照以下主要步骤完成菌株ΧΚ-2菌剂的制备：
[0053] (1)将实施例1所得解淀粉芽孢杆菌ΧΚ-2菌株接种于LB固体培养基，于29°C下 培养22h，活化菌株；LB固体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂 粉 20g，NaOH 调 pH 至 7. 1，121°C、20min 高压灭菌。
[0054] (2)将步骤（1)活化的菌株接入LB液体培养基中，于29°C下120r/min振荡培养 22h，制成种子液；LB液体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，NaOH调 pH 至 7. 1，121°C、20min 高压灭菌。
[0055] (3)将步骤（2)所获的种子发酵液按体积比5%接种于LB液体发酵培养基中，于 29°C下 120r/min 振荡培养 42h。
[0056] 按以上步骤即制得解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂。
[0057] 三、解淀粉芽孢杆菌XK-2在防治西瓜枯萎病中的应用
[0058] 将实施例2所制备的解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂稀释至I. 0X 10scfu/mL，0D6。。= 0. 78-0. 80,用于西瓜枯萎病的盆栽防治试验。
[0059] 玉米砂培养基制作：取干燥无霉变的玉米粒粉碎物淘洗干净后浸泡24h，滤干水 后装入250mL三角瓶中，121°C、灭菌30min，冷却后备用。
[0060] 含病原菌盆栽土的准备：将PDA平板中活化的西瓜枯萎病菌丝块接入上述盛有玉 米砂培养基的三角瓶中，每瓶4-5块，置于25°C培养箱中培养。IOd后将病原菌接种物与灭 菌土以1:15的质量比例混合均匀，制成含病原菌盆栽土，分装于营养钵，每钵约l.OKg。
[0061] 将西瓜种子常丰新西农8号（中度抗病）催芽后育苗，当西瓜苗长至3片真叶时 准备移栽，移栽前将西瓜苗在上述)(K-2菌剂稀释液中浸泡30min，并在盛有病原物接种土 的营养钵中打下约IOcmX 5cm大小的孔穴，接入50mL上述XK-2菌剂稀释液，以无菌水为空 白对照。三次重复，每处理20株，一个月后，拔起西瓜苗，纵剖维管束，观察发病情况，根据 西瓜枯萎病的分级标准调查各处理的病情，根据以下公式计算病情指数和相对防效。
[0062] 病情指数=Σ [病级数X该级病株数V (调查总数X最高病级数）X 100
[0063] 相对防效（％) = (对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数X 100%
[0064] 西瓜枯萎病的分级标准：
[0065] 0级：莖内维管束正常，无变色；
[0066] 1级：莖内维管束20%以下变色；
[0067] 2级：茎内维管束20% -40 %变色；
[0068] 3级：茎内维管束40% -60 %变色；
[0069] 4级：茎内维管束60% -80 %变色；
[0070] 5级：莖内维管束80%以上变色。
[0071] 为经XK-2菌剂处理的对照组均达到了西瓜枯萎病的分级标准的5级，其茎内维管 束变色严重，采用XK-2菌剂处理的实验组的茎内维管束变色严重程度有明显减轻，为西瓜 枯萎病分级标准1级。解淀粉芽孢杆菌)《-2对西瓜枯萎病的室内盆栽防治试验结果见表 2,对照的病情指数为86. 7, )(K-2菌剂处理的西瓜枯萎病病情指数为23. 3,其相对防治效果 达 73. 1%。
[0072] 表2 :解淀粉芽孢杆菌)(Κ-2对西瓜枯萎病的室内防治效果
[0073]
[0074] 实施例2
[0075] 实施例2与实施例1基本相同，区别在于：
[0076] 本实施例按照以下主要步骤完成菌株XK-2菌剂的制备：
[0077] (1)将实施例1所得解淀粉芽孢杆菌XK-2菌株接种于LB固体培养基，于30°C下 培养24h，活化菌株；LB固体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂 粉 20g，NaOH 调 pH 至 L 2,121°C、20min 高压灭菌。
[0078] (2)将步骤（1)活化的菌株接入LB液体培养基中，于30°C下120r/min振荡培养 24h，制成种子液；LB液体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，NaOH调 pH 至 7. 2,121°C、20min 高压灭菌。
[0079] (3)将步骤（2)所获的种子发酵液按体积比5%接种于LB液体发酵培养基中，于 30°C下 120r/min 振荡培养 44h。
[0080] 按以上步骤即制得解淀粉芽孢杆菌)(K-2菌剂，将所得解淀粉芽孢杆菌)(K-2菌剂 稀释至有效成分含量1. 〇 X 107cfu/mL后使用。
[0081] 实施例3
[0082] 实施例3与实施例1基本相同，区别在于：
[0083] 本实施例按照以下主要步骤完成菌株XK-2菌剂的制备：
[0084] (1)将实施例1所得解淀粉芽孢杆菌XK-2菌株接种于LB固体培养基，于28°C下 培养20h，活化菌株；LB固体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂 粉 20g，NaOH 调 pH 至 7. 0,121°C、20min 高压灭菌。
[0085] (2)将步骤（1)活化的菌株接入LB液体培养基中，于28°C下120r/min振荡培养 20h，制成种子液；LB液体培养基配制：酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，NaOH调 pH 至 7. 0,121°C、20min 高压灭菌。
[0086] (3)将步骤（2)所获的种子发酵液按体积比5%接种于LB液体发酵培养基中，于 28°C下 120r/min 振荡培养 40h。
[0087] 按以上步骤即制得解淀粉芽孢杆菌)(K-2菌剂，将所得解淀粉芽孢杆菌)(K-2菌剂 稀释至有效成分含量1. 〇 X 106cfu/mL后使用。
[0088] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和 原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC M 2015299,命名为解淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens))(K-2。2. 如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌)(K-2的 16S rDNA 序列如 SEQ ID No. 1 所示。3. 权利要求1或2所述解淀粉芽孢杆菌在抑制西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐 病菌中的应用。4. 一种如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的筛选方法，其步骤包括： (1) 从西瓜植株的根部中分离芽孢杆菌； (2) 用平板对峙法从步骤（1)分离的芽孢杆菌中筛选出对西瓜枯萎病菌有抑菌作用的 菌株。5. 如权利要求3所述的解淀粉芽孢杆菌)(K-2的筛选方法，其特征在于：步骤（1)所述 西瓜植株的根部经过酒精浸泡、升汞浸泡、无菌水漂洗后，加入无菌水进行研磨，混合均匀 制为悬浮液，所述分离芽孢杆菌是将悬浮液稀释后涂布于LB平板，28-30°C下培养23-26h， 挑取芽孢杆菌单菌落；步骤（2)所述平板对峙法具体步骤为：将西瓜枯萎病菌接种在PDA 平板中心，将步骤（1)所得细菌呈三角状对称接入PDA平板，距离中心l-3cm，28°C下培养， 得到有抑菌作用菌株，转入LB平板上培养保存。6. -种解淀粉芽孢杆菌)(K-2菌剂，其特征在于：所述菌剂为解淀粉芽孢杆菌)(K-2经 活化、种子培养、发酵后得到的菌剂。7. 如权利要求6所述的解淀粉芽孢杆菌)(K-2菌剂，其特征在于：所述活化为将解淀粉 芽孢杆菌XK-2接种于LB培养基中，于28-30°C下培养20-24h。8. 如权利要求6所述的解淀粉芽孢杆菌)(K-2菌剂，其特征在于：所述种子培养为将经 活化后的解淀粉芽孢杆菌XK-2菌株接种于培养基中，于28-30°C、115-125r/min下振荡培 养 20-24h。9. 如权利要求6所述的解淀粉芽孢杆菌)(K-2菌剂，其特征在于：所述发酵为将经种 子培养后的解淀粉芽孢杆菌XK-2菌株以5%的接种比例接种于培养基中，于28-30°C、 115-125r/min 下振荡培养 40-44h。10. 如权利要求6至9任一项权利要求所述的解淀粉芽孢杆菌)(K-2菌剂，其特征在于： 所述的解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂稀释至有效成分含量I. 0 X IO6-L 0 X IO8CfuAiL后使用。
【专利摘要】本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌，其保藏号为CCTCC？M？2015299，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus？amyloliquefaciens)XK-2。并进一步提供了解淀粉芽孢杆菌XK-2的筛选方法和在抑制西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌中的应用，以及一种解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂。解淀粉芽孢杆菌XK-2是一株西瓜内生菌株，对人、畜、农作物安全，对环境友好，具有较广的抑菌谱，对常见的土传病原菌，西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌、核桃根腐病菌菌丝生长均具有较好的抑制效果。解淀粉芽孢杆菌XK-2菌剂对西瓜枯萎病具有显著的防治效果，对西瓜枯萎病菌菌丝生长有明显抑制作用，使菌丝生长缓慢，出现畸形症状，在植物病害的生物防治中具有广阔的应用前景。CCTCC M 201529920150515
【IPC分类】C12N1/20, A01N63/00, A01P3/00, C12R1/07
【公开号】CN105018385
【申请号】CN201510462700
【发明人】孙正祥, 周燚, 邓建新
【申请人】长江大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月31日