m离心5min;将上清移入新的三角锥形瓶中，加入约 1/6体积的PEG/NaCl溶液，混匀后4°C静置过夜；将混合液4°C、lOOOOrpm离心15min，弃去 上清，用lmlTBS重悬沉淀，4°C、10000rpm离心3-5min，将上清移入新的EP管，加入1/6体 积的PEG/NaCl溶液，冰浴lh;4°C、lOOOOrpm离心 15min，弃去上清，以 200y1 0? 02%
[0096] NaN3溶液重悬沉淀物，微离心后取上清，即为第一轮回收扩增的噬菌体，用于滴定 和下一轮筛选。
[0097] (7)扩增后噬菌体数量的滴定（方法同4)
[0098] ⑶取扩增后的噬菌体5xl010pfu，用于下一轮的筛选。第二、三轮筛选洗涤液 Tween-20浓度依次提高到0. 5%和1. 0%，孵育时间依次减少至45min和30min，并且洗涤 次数增加至8次和10次，其余条件、步骤与第一轮相同。结果如图1所示。
[0099] 表一 3轮筛选对阳性噬菌体克隆的富集效应
[0100]
[0101] 结果显示：第一轮筛选得率约为6x10-8,第二轮筛选得率约为5. 4x10-6,第三轮 筛选得率约为7. 8x10-5, 3轮筛选后阳性噬菌体富集了约1300倍。
[0102] 6、噬菌体单克隆的挑取
[0103] ⑴将第3轮筛得的噬菌体测定滴度。
[0104] ⑵将ER2738过夜培养物按1:100稀释接种于LB培养基，分成1ml每等份，挑取分 离良好的单个蓝色噬菌斑到上述lml培养管中进行扩增，250rpm/min，37°C摇床培养4h。
[0105] ⑶培养物转入微量离心管中，10000r离心5min。
[0106] ⑷用移液器将80%的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液，置于4°C贮 存。
[0107] 7、ELISA鉴定噬菌体单克隆对HR4单抗的亲和力
[0108] ⑴96孔板中按照1yg/孔加入纯化后的HR4单克隆抗体，4°C孵育包板过夜；
[0109] (2)PBS稍洗，1%PBS-BSA封闭2h后，加入滴度约lOlOpfu的噬菌体，37°C孵育2h， ?851'-0.05%洗6次，1111111/次；
[0110] ?加111^-311衍]\113抗体，37°(：孵育111，？851'-0.05%洗3次，1111111/次 ；
[0111] ⑷用TMB显色，HC1终止反应，酶标仪450nm处读数。随机挑取噬菌体原库蓝斑作 为对照，P/N>2. 1为阳性。
[0112] 噬菌体肽库经过连续三轮筛选后，随机挑选30个噬菌体克隆，分别命名为 phage-1、phage-2、phage-3、…、phage-30。菌体原库蓝斑作为对照，利用ELISA初步 鉴定噬菌体克隆对HR4单克隆抗体的亲和力，检测图片如图2、图3所示。
[0113] 当P/N(0D克隆/0D随机对照克隆）>2. 1时，即可说明此克隆对HR4单克隆抗体有 高亲和力。ELISA结果显示P/N>2. 1的阳性克隆有23个。
[0114] 8、扩增噬菌体单克隆
[0115] ⑴将大肠杆菌ER2738单菌落接种到20mlLB培养基中，摇床培养至对数生长前期 (0D600 值达到 0? 485 左右，即 37°C，250rpm培养 3-4h);
[0116] ⑵将上一步鉴定的噬菌体阳性克隆保存液取10ul加入ER2738菌液，37°C、250rpm 培养3. 5h，lOOOOrpm离心5分钟，上清加入1/6体积的20%PEG/NaCl室温沉淀lh;
[0117] ⑶lOOOOrpm离心10分钟，去上清，沉淀用lmlTBS重悬，4°C保存备用。
[0118] 9、提取噬菌体单链DNA、测序
[0119] ⑴取噬菌体克隆扩增液500yL，10000转离心15s，去沉淀（清除残余大肠杆菌 ER2738)；
[0120] ⑵加 200yL20%PEG/NaCl，混匀室温放置 15min以上，lOOOOrpm离心lOmin，取 沉淀；
[0121] ⑶用100yLTE(PH= 8. 0)溶解沉淀，加100yLTris饱和酚，上下颠倒lmin，再 静置lmin，再上下颠倒约lmin混勾；
[0122] (4)lOOOOrpm离心5min，取上层加入300y1 3mol/L乙酸钠：无水乙醇（1:25)沉 淀DNA，混勾后静置约30min，lOOOOrpm离心10min，去上清，加100yL70%乙醇，lOOOOrpm， lOmin，吸去上清，风干残余乙醇，用40yLTE(PH= 8. 0)溶解，琼脂糖凝胶电泳鉴定；
[0123] (5)用肽库自带测序引物-96gIII引物送苏州金唯智生物科技有限公司测序。
[0124] 测序引物为：5' -CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3' 距目的片段相距 96bp。
[0125] 10、推导获得外源多肽核苷酸及氨基酸序列
[0126] 测定出的序列是与引物-96111连接的随从链，先找出引物-288111(5'-61六1666八丁 TTTGCTAAACAAC-3'）的位置，再找到引物-28gIII后6个碱基的Egal酶切位点CGGCCG;从 Egal酶切位点向后数10个碱基，就可以找到12肽的插入序列；插入序列后是KPnl酶切位 点GGATCC。阅读出随从链5'H0端到3'端的插入序列，并把三连密码子分开，按照A-T、 G-C互补原则，得到模板链的碱基序列（换方向）按照三联密码子翻译成多肽。
[0127] 11、氨基酸序列的比对分析
[0128] 利用Primer软件将插入序列的DNA转换成氨基酸序列，初步分析比对各个序列之 间是否有共有序列。
[0129] 测序结果显示：23个噬菌体阳性单克隆插入的外源多肽序列为1条不同的序列， 我们将这条序列分别命名为PT1。
[0130] 用肽库自带测序引物_96gIII引物送苏州金唯智生物科技有限公司测序。
[0131] 测序引物为：5' -CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3' 距目的片段相距 96bp。用DNAStar 软件分析测序获得的噬菌体外源基因，以下为PT1的序列信息：
[0132] CTTTGGCCGTTATGTAATCAGCAATAAGTTGAAATGTGGTAATTCCTAAATCTCAACTGATGAATCTTT CTACCAGTAATAAATGTGTCCCGTAGTCGATTTATAACGTAGATTTTACTTCCCAACGTCCTGACTGGTATAATGAG CCAGTTCATAAAATCGCATAAGGTAATTCACAACATTAAAGTTGAAAATAAAACCATCTCAAGCCAAATTACTACTC GTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAGCCTTATTCACTGAATGAGCAGCTTTGTACGTTGATTTGGGTAATGAATATC CGGTTCTGTCAAGATTACTCTTGATGAAGGTCAGCCAGCCTATGCGCCTGGTCTGTACACCGTTCATCTGTCCTCTT TCAAAGTTGGTCAGTTCGGTTCCCTTATGATTGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTAAGTAACATGGAGCAGGTCGC GGATTTCGACACAATTTATCAGGCGATGATACAAATCTCCGTTGTACTTTGTTTCGCGCTTGGTATAATCGCTGGGG GTCAAAGATGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTTGCCTCTTTCGTTTTAGGTTGGTGCCTTCGTAGTGGCATTACGTATT TTACCCGTTTAATGGAAACTTCCTCATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCTCTGTAGCCGTTGCTACCCTCGTTC CGATGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGA ATATATCGGTTATGCGTGGGCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAAATTC ACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTG AAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTGGTACCTTTCTATTCTCACTCTTTTAATAAGTGGATGGATTGTCTGA GTGTTACGCATGGTGGAGGTTCGGCCGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAATCCCATACAGAAAATCATTACTG ACGTCTGGGAGACGCCAAATTTCAGGTGT
[0133] 两标志性酶切位点之间序列为：
[0134] TTTAATAAGTGGATGGATTGTCTGAGTGTTACGCAT
[0135] 即噬菌体外源核苷酸序列为：
[0136] 5, -TTTAATAAGTGGATGGATTGTCTGAGTGTTACGCAT-3，
[0137] 转换为氨基酸序列为：FNKWMDCLSVTH
[0138] 12、阳性噬菌体克隆与HR4单抗特异性结合的分析
[0139] ⑴96孔板中按照1yg/孔加入纯化后的HR4单克隆抗体，人CEA单抗和BSA分别 包板，4 °C孵育包板过夜；
[0140] ⑵PBS稍洗，1%PBS-BSA封闭2h后，分别加入滴度约lOlOpfu的纯化噬菌体PT1， 纯化噬菌体PT1，对照噬菌体（第一轮淘洗中未结合的噬菌体），37°C孵育2h，PBST-0. 05% 洗6次，lmin/次；
[0141] 加111^111衍]\113抗体，37°(：孵育111，？851'-0.05%洗3次，1111111/次；用1]\?显色， HC1终止反应，酶标仪