450nm处读数。
[0142] 结果如图4所示，实验结果表明phage-PTl可以特异性的与人HR4单克隆抗体结 合，而不与人CEA单抗和BSA结合。
[0143] 根据以上实验结果，确定多肽PT1模拟了HR4表位，为进一步的疫苗构建工作打下 基础。
[0144] 13、HR4表位模拟肽疫苗的构建
[0145] 1.HR4的模拟表位PT1的人工合成
[0146] 多肽表位PT1 (TFKFTLSYRQVH)，PT1 (TFKFTLSYRQVH)由辉源生物科技（上海）有限 公司采用多肽固相合成技术进行化学合成，纯度95%以上。同时合成对照多肽。
[0147] 2.PT1与HR4单抗特异性结合实验
[0148] ⑴以2mg/LPT1和对照多肽包被96孔酶联板，每孔100y1，4°C孵育过夜。
[0149] ⑵倾去包被液，于每孔中加入封闭液（5mg/LBSA，0? 1MNaHC03,pH8. 6)，4°C封闭 2h〇
[0150] ⑶倾去封闭液，TBST洗6次，每次均要将96孔板倒扣在洁净的纸巾上，轻扣除尽 残余液体。
[0151] ⑷将人HR4单克隆抗体，人CEA单克隆抗体分别加入对应的孔中（100ng/100y1/ well)，室温反应lh。TBST洗6次，各孔分别加入HRP标记羊抗兔IgG或HRP标记羊抗鼠 IgG，室温孵育lh。TBST洗3次，lmin/次。用TMB显色，HC1终止反应，酶标仪450nm处读 数。
[0152] 3.构建PT1-CTB-脂质体复合物，以0. 9%无菌氯化钠溶液溶解多肽和CTB，然后加 入相同体积的脂质体Lipofect，使每200y1含多肽100yg，含CTB5yg，4°C静置过夜，次 日晨取出，升至室温（25°C)，备用。
[0153] 14、疫苗免疫效果鉴定
[0154] 1实验材料和仪器
[0155] 1.1实验材料
[0156] 雄性Wistar大鼠30只，体重250~300g(北京华阜康）。
[0157] 1.2主要试剂
[0158] IFN-r，IL-2,IL-6抗体 博耘众欣生物，天津
[0159] IFN-r，IL-2,IL-6ELISA 检测试剂盒博谷生物，上海
[0160] OVASIGMA，美国
[0161] TRIZOLInvitrogen，美国
[0162] 荧光定量PCR试剂盒 Takara，日本
[0163] 荧光定量PCR引物合成 华大基因，北京
[0164] 氛，氯仿，异丙醇等RNA提取所需试剂科密欧，天津
[0165] DEPC 鼎国，北京
[0166] RNasinPromega，美国
[0167] M-MLVPromega，美国
[0168] BLOTTO 博耘众欣生物，天津
[0169] 1XTBST 博耘众欣生物，天津
[0170] HRP标记羊抗兔IgG 博耘众欣生物，天津
[0171] 细胞裂解液 博耘众欣生物，天津
[0172] 蛋白电泳用5Xloadingbuffer博耘众欣生物，天津
[0173] 1.3 仪器
[0174] 干燥消毒烤箱（DHG-9246A) 上海精宏试验设备有限公司
[0175] 台式离心机 Eppendorf，德国
[0176] 低温高速离心机（f5417〇Eppendorf，德国
[0177] 垂直电泳槽 北京六一仪器厂
[0178] 电泳仪 北京六一仪器厂
[0179] 转移电泳槽 Bio-Rad，美国
[0180] 紫外分光光度计 Bio-tek，美国
[0181] 荧光定量PCR仪 Bio-Rad，美国
[0182] 6131生物分光光度计 德国Eppendorf公司
[0183] 酶联免疫检测仪 尤尼柯（上海）仪器有限公司
[0184] 2?实验方法及结果
[0185] 2. 1变应性鼻炎（AR)动物模型构建及分组
[0186] 适应环境7d后，所有实验组均于第1天给予腹腔注射0VA生理盐水溶液 0. 5ml(100mg/ml)和A1 (0H) 3胶体（40mg/ml) 0. 5ml。第8天腹腔加强注射0VA生理盐水溶 液0. 5ml(10mg/ml)和A1 (0H) 3胶体（40mg/ml) 0. 5ml。对照组于第1天和第8天各给予腹 腔注射生理盐水lml。第22天起，实验组每侧鼻腔给予5 % 0VA生理盐水溶液25y1点鼻， 每日1次，连续1周，之后每周2次給予5% 0VA生理盐水溶液25y1点鼻，直至第85天。 对照组自第22天起连续1周和至第85天的2次/周的生理盐水点鼻。
[0187] 2. 2动物实验分组
[0188] Sl、PT1疫苗治疗组：常规0VA致敏动物，分别在14、21天经鼻给予疫苗；
[0189] S2、对照疫苗治疗组：常规0VA致敏动物，分别在14、21天经鼻给予对照疫苗；
[0190] S3、PT1疫苗预防组：经鼻给予疫苗一周后，常规0VA致敏动物；
[0191] S4、对照疫苗预防组：经鼻给予对照疫苗一周后，常规0VA致敏动物；
[0192] S5、HR4拮抗剂治疗组：常规0VA致敏动物，分别在0, 7天经鼻给予HR4受体拮抗 剂；
[0193]S6、对照组（单纯AR大鼠）
[0194]S7、正常大鼠
[0195] 2. 3 取材
[0196] 将WiStar大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3~0.35g/Kg)进行麻醉，麻醉完全 后，将大鼠固定在手术台上，然后迅速开胸暴露心脏，从心脏采血5ml，采集的血液在室温 下静置2h，离心1500g，15min，收集血清于干净的EB管中-20°C冷冻保存。
[0197]另外取支气管灌洗液并获取鼻腔粘膜组织。
[0198] 2. 4ELISA检测血清与HR4的结合
[0199]S1、准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。
[0200]S2、配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。
[0201] S3、加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标 准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50yL;待测 样本孔中加入含有相当于lmg总蛋白的待测样本，再加样本稀释液至50yL;空白对照孔不 加。
[0202] S4、温育：37°C水浴锅或恒温箱温育30min。
[0203]S5、洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置lmin，甩去洗涤液，吸 水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。
[0204]S6、加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50yL，空白对照孔不加。
[0205]S7、温育：37°C水浴锅或恒温箱温育30min。
[0206]S8、洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置lmin，甩去洗涤液，吸 水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。
[0207]S9、显色：每孔先加入显色剂A液50yL，再加入显色剂B液50yL，平板混匀器混 匀30s(或用手轻轻震荡混匀30s)，37°C避光显色15min。
[0208]S10、终止：取出酶标板，每孔加终止液50yL，终止反应（颜色由蓝色立转黄色）。
[0209]S11、测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值 (0D值）。
[0210]S12、计算：根据标准品的浓度及对应的0D值，计算出标准曲线的直线回归方程， 再根据样本的0D值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计 算。
[0211] 结果如图6所示，ELISA检测血清与HR4的结合，实验结果表明与对照疫苗及正常 大鼠相比，PT1疫苗治疗及预防组均可以产生特异性抗体并与人HR4结合。
[0212] 2. 5ELISA检测血清中IFN-r,IL-2,IL-6 表达水平
[0213] 实验方法同上述2. 4。
[0214] 如图7所示，实验结果表明与对照疫苗相比，PT1疫苗治疗及预防组IFN-r，IL-2表 达水平均上调，IL-6表达水平下调。
[0215]2. 6Real-timePCR检测血细胞中IFN-r,IL-2,IL-6表达水平
[0216]RNA提取
[0217] ①离心收集细胞，加入lmlTrizol液。
[0218] ②室温放置5分钟。
[0219] ③加入200y1氯仿，充分倒置混勾，14000rpm, 4°C离心15min。
[0220] ④小心吸出上清至新的Eppendorf管中，每管加入_20°C预冷的异丙醇600y1，室 温放置30min。
[0221] ⑤ 14000rpm, 4°C离心lOmin，弃上清。
[0222] ⑥每管加入lml75%的乙醇，弹起沉淀，12000rpm离心lOmin，弃上清。
[0223] ⑦重复步骤6-次。
[0224] ⑧室温静置5min干燥。
[0225]⑨每管加入 20u1RNase-free水溶解 5min。
[0226] ⑩待沉淀完全溶解后，每管取出1y1溶解于9y1RNase-free水中.
[0227] 采用紫外分光光度法测定RNA在260nm和280nm的吸光度，计算RNA含量（260nm 的0D= 1相当于RNA含量40yg/ml)。各样本总RNA的A260/A280的值均在1. 8 - 2. 1范 围内。取1y1样品，进行1 %琼脂糖电泳。80V，10-15分钟，凝胶成像系统拍照。
[0228] ⑵荧光定量PCR检测
[0229] ①在0. 5mL离心管中制备以下反应混合物