b为双酶 切鉴定图，其中M为DNA分子量标准；1~4为重组质粒。
[0028] 图5为实施例4中含有重组质粒pET-32a(+)-NiR的E. coli BL21经过诱导表达 后所得到的粗酶液（重组组）、空白质粒pET-32a(+)的E.coli BL21诱导表达后所得到的 粗酶液（阴性对照组）和含重组质粒pET-32a(+)-NiR的E. coli BL21不经诱导表达所得 到的粗酶液（阳性对照组）通过SDS-PAGE电泳后的结果，其中1为阴性对照组；2为阳性 对照组；3重组组。
[0029] 图6为纯化后NiR蛋白质的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白质分子量标准；1，2为 纯化后的蛋白，3为阴性对照组，4为阳性对照组，5为重组组。
[0030] 图7为经亲和层析纯化后的NiR的凝胶色谱层析（GPC)图。
[0031] 图8为经亲和层析纯化后的NiR的非变性聚丙烯酰胺电泳图。其中1，2道为重组 蛋白；M为卵清蛋白，分子量为45KDa。
[0032] 图9为重组蛋白氧化态和还原态UV-可见光全波长扫描。其中a为氧化态NiR全 波长扫描图；b为还原态NiR全波长扫描图。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但是本发明要求保护范围并不局限 于此。
[0034] 实施例1
[0035] 蜡样芽孢杆菌LJ01中NiR基因的克隆表达，包括如下步骤：
[0036] 根据GenBankK'中的DNA序列，设计出NiR基因的PCR引物：上游引物为Ml: 5' -GATGCCATGGATGAGTTATGAAAA AGTAT-3'（Ncol)，如 SEQ IDN0.2,下游引物为 M2: 引物；
[0037] 根据试剂盒中的说明书的步骤（细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver. 2. 0,为Takara Biotechnology公 司的产品，购自广州瑞真生物技术有限公司），进行蜡样芽孢杆菌中基因组DNA的提取、NiR 基因的克隆、PCR目的片段的回收。
[0038] 以提取的蜡样芽孢杆菌基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增目的基因片段，PCR 反应体系为：5yL 10Xbuffer;4yL dNTP;lyL 引物 〇?1，]\12);0.25 1^高保真酶；3 1^ DNA;35. 75 yL无菌水，PCR反应条件为：94°C预变性4min ;94°C变性30s，55°C退火30s， 72°C延伸2min，共30个循环。用1 %琼脂糖电泳检测目的基因PCR产物；电泳检测结果如 图1中1、2、3条带，在1600KD附近有一条明显的DNA条带，该条带为经过上述步骤扩增所 得的蜡样芽孢杆菌LJ01的NiR基因DNA序列，经测序，结果如序列。
[0039] 将所得的LJOINiR的基因DNA序列与质粒pET_32a (+)(为美国Novagen公司产品， 购自上海吉然生物科技有限公司）分别进行NcoI、SalI单酶切，于37°C过夜反应20h，接着 分别回收片段DNA和质粒DNA。
[0040] 将上述两个片段进行连接，在连接反应体系中，于16°C下进行连接14~16h，即获 得重组质粒pET-32a (+) -NiR，所述的连接反应体系为：回收酶切pET-32a (+) 7 y L，回收目 的基因片段1 y L，T4DNA连接酶1 y L，T4DNA连接酶缓冲液1 y L ;
[0041] 将构建好的表达载体pET-32a(+)-NiR质粒，转入E. coli BL21感受态细胞中，获 得重组大肠杆菌，重组菌的菌落见图2,从图中可以看出，阴性组中未长出菌落，而阳性组的 菌落较多，说明感受态细胞制备成功，于重组质粒组平皿上挑取10个单菌落进行PCR初步 鉴定。
[0042] 用PCR进行扩增，获得重组菌BL2110个菌落的目标片段NiR基因，结果如图3， 其中只有3和10菌落无法扩增出NiR目的片段，其余8株菌均能扩增出目的片段；质粒 pET-32a(+)-NiR用单酶切和双酶切方法鉴定，鉴定结果见图4所示，从图4a中清楚可见重 组质粒经单酶切后有一个条带，且分子量与第二条Marker接近，与理论中重组质粒的大小 7500bp吻合；从图4b中清楚可见重组质粒经双酶切后有两个条带，且一条大小在lOOObp 和2000bp之间约1600bp左右，另一条则在4000bp和7000bp之间约6000bp，说明构建好 的载体经酶Ncol和Sail分别在CCATGG、GTCGAC的位点双酶切成两条片断，说明重组质粒 pET-32a(+)-NiR 构建成功。
[0043] 所述的LB液体培养基为：按如下配方称取蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g， 然后用蒸馏水定容至1L，在121°C下灭菌20min冷却后即得。
[0044] 所述的LB固体培养基为：指在LB液体培养基中加入15g琼脂，然后用蒸馏水定容 至至1L，灭菌冷却后即得。
[0045] 实施例2
[0046] 利用实施例1所得的重组E. coli BL21进行蜡样芽孢杆菌NiR的诱导表达，具体 如下：将实施例1所得的阳性克隆菌种涂平板于LB固体培养基（含50 y g/mL氨苄青霉素） 上，于37°C恒温箱中过夜培养，然后从固体培养基（含50 yg/mL氨苄青霉素）上挑取单菌 落接种到液体培养基（含50 y g/mL氨苄青霉素）中，于37°C和180rpm下过夜培养；然后以 体积百分比2%接种量接种1^液体培养基（含5〇11 8/1^氨苄青霉素），于37°(：和180印111 下培养至对数生长期（〇D_= 0. 6)时，加入终浓度为lmmol/L的IPTG进行诱导，于30°C和 180rpm下诱导培养4~5h后，得培养液，离心收集培养液菌体，提取NiR，其具体步骤如下：
[0047] 将培养液用8000rpm离心收集菌体，用无菌水清洗两次，每100mL培养液加入10mL 已4°C预冷的0. 02mol/L的Na2HP04_NaH2P04缓冲液（pH 7. 4)，冰浴超声波破碎菌体10min， 每超声2s停2s，超声后取出，于4°C、9000rpm离心10min，取其上清液为NiR的粗蛋白液， 于4°C下保存备用。
[0048] 同时设立对照组，一组为加IPTG诱导的含有空质粒的BL21组（阴性对照组），另 一组为不加IPTG诱导的含重组质粒的BL21组（阳性对照组），同时按本实施例的诱导表达 过程进行诱导表达，对阴性对照组和阳性对照组的菌体蛋白进行相同条件的超声破碎和离 心收集后收集粗酶液，在相同浓度下进行SDS-PAGE分析，结果如图5所示，3为加IPTG诱 导的含有重组质粒的BL21组粗酶液；2为不加IPTG诱导的含重组质粒的BL21组粗酶液；1 为加IPTG诱导的含空质粒的BL21组粗酶液。从图中可以看出1和2组的蛋白基本一致， 而与前两条带相比，条带3在箭头所指的位置多出3处条带a、b、c，说明含有重组质粒的重 组大肠杆菌在经IPTG诱导下产生了新的蛋白，该重组蛋白可能成功得到表达，是否有降解 亚硝酸盐的活性，需要进一步验证。
[0049] 实施例3
[0050] 利用实施例2所得的重组大肠杆菌诱导表达的粗蛋白液进行亲和层析纯化，得到 高纯度的NiR，所述的亲和层析步骤为：先用3-5倍体积的含20mM咪唑的磷酸盐缓冲液平 衡Ni柱，上样后先用同样的缓冲液将杂蛋白洗脱下来，洗至基线后再用含500mM咪唑的磷 酸盐缓冲液进行洗脱得到重组蛋白，其产量为1L发酵液中可得到20-30mg重组蛋白。洗脱 出的蛋白经聚乙二醇20000浓缩后进行SDS-PAGE检测，其结果见图6,其中M为标准品，条 带1为上样量30mL洗脱出的蛋白，条带2为上样量为70mL洗脱出的蛋白，对比条带1和条 带2得出箭头所指约20KDa出为目的蛋白NiR，对照3,4, 5条带说明图5中箭头3所指的条 带为重组蛋白，同时发现其中还有少许杂带，还需要进行下一步来确定其纯度。
[0051] 实施例4
[0052] 将实施例3得到的重组蛋白进行凝胶渗透色谱柱层析法（GPC)检测，利用浓度为 将样品配制成1~2mol/L的溶液，过0. 45 y m过滤膜，进样体积为20 y L。