重组蛋白的凝胶 渗透色谱法（GPC)见图7,图中可见在11. 894min时出现一个大峰，而在13. 549min处出现 一个极小的峰，而重组蛋白已检测到活性，因此可以说明经亲和层析柱洗脱下的蛋白大部 分为目标蛋白，且其出峰时间与分子量为45KDa的鸡卵清蛋白标准品的出峰时间接近，因 此判断其分子量约为40KDa。
[0053] 将实施例3得到的重组蛋白进行非变性聚丙烯酰胺电泳检测，结果见图8,其中泳 道1，2为重组蛋白。图中显示泳道1，2均为单一条带，说明样品蛋白为单一蛋白，因此推测 图6中1，2道中上方的条带为聚合物，同时重组蛋白较天然蛋白相比多了组氨酸头，因此导 致重组NiR的单体分子量与预测的天然NiR分子量有差异。而根据图8中卵清蛋白分子量 判断，该NiR重组蛋白的天然分子量约为40KDa，综上所述，该重组蛋白可能为二聚体。
[0054] 实施例5
[0055] 将实施例3得到的重组蛋白透析除去咪唑并用聚乙二醇20000浓缩至蛋白浓度为 lmg/mL的重组蛋白进行酶活测定，当酶活体系为500yL:含100yL重组蛋白液，100yL的 NaN02溶液（浓度为500yg/mL)，300yL的磷酸盐缓冲液，上述体系中无法降解亚硝酸盐， 24h后检测似勵2的含量为93. 46yg/mL;当添加100yL的细胞色素c(浓度为0. 5mg/mL) 时，体系能降解亚硝酸盐，经过24h的降解，将终浓度为100yg/mL的NaN02降解为0,其NiR 酶活为668. 40U，其中NiR的活力单位定义为：在37°C条件下，每分钟催化还原lng亚硝酸 钠所用酶量为一个酶活力单位。酶活计算公式如下：Activity(U) =m/(M't)，其中m为降 解的亚硝酸钠的质量，单位为ng ;M为反应物中酶蛋白质的质量，单位为mg ;t为反应时间， 单位为min。申请号为2014103909 80. 0的中国发明专利公开了"一种蜡样芽孢杆菌及其 在制备NiR中的应用"，在该应用中最后经葡聚糖凝胶纯化后的NiR酶活为4004. 89U，分析 重组蛋白酶活降低的原因，可能是因为重组蛋白中添加的6个组氨酸暴露在蛋白表面，使 得电子供体蛋白和酶的结合位点面积减小，因此需要更长的时间来进行降解。上述实验结 果表明，只有在电子供体蛋白的参与下，亚硝酸盐还原酶才有降解亚硝酸盐的酶活。
[0056] 实施例6
[0057] 将实施例5得到的NiR进行UV-可见光全波长扫描测定。氧化态NiR样品制备： 配制0. 1M铁氰化钾溶液，按3 y L/mL比例添加入酶液；还原态NiR样品制备：直接在酶液 中加入少许结晶状连二亚硫酸钠。结果见图9,从中可看出，氧化态NiR在419nm，451nm 以及547nm处有吸收峰，而还原态的NiR在407nm，454nm，547nm和724nm处有吸收峰，对 比 Besson 研究的 Pseudomonas nautica 中 cdl 型 NiR 的全波长图[Besson S, Carneiro C, Moura J J G, Moura I, Fauque G. A cytochrome cdl-type nitrite reductase isolated from the marine denitrifier Pseudomonas nautica 617:purification and charact erization, Anaerobe, 1995, 1:219-226.]，发现重组蛋白可能存在血红素c的特征吸收峰 (547nm)，然而没有血红素dl的特征吸收峰（629nm)。
[0058] 实施例7
[0059] 将实施例5得到的NiR用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS)法检测其中的金属元 素含量，主要测定元素为铁和铜。其中ICP条件：高频发生器输出功率：1. 55kW，等离子体 气（氩气）：15.0L/min，辅助气（氩气）：0.8L/min，载气（氩气）：0.8L/min，补偿气（氩 气）：0. 35L/min，采样深度：10mm ;MS条件：扫描方式：跳峰，测量点/峰：3点，扫描质量数： 63Cu, 56Fe, 72Ge (内标）；碰撞池条件：碰撞气：氦气，4. 3mL/min ;进样条件：自动进样，溶 液提升速率：〇. 4rps，溶液提升时间：30s，溶液稳定速率：0. lrps，溶液稳定时间：30s，内标 元素Ge通过T型三通管在线引入，雾化器：MicroMist ;雾化室温度：2°C;清洗条件：进样口 水清洗进样针外壁15s，进样管道分别用5%硝酸溶液和水清洗20s。检测结果为：铁的含 量为0. 034mg/L ;铜的含量为0. 123mg/L，样品浓度为2/3mg/mL，因此最后得到样品中铁的 含量为铁的含量为51mg/Kg，铜的含量为184. 5mg/Kg，说明重组蛋白中同时含有铁和铜两 种金属元素，且铜的含量约为铁的3. 6倍。经过以上步骤得到的NiR蛋白，在电子供体蛋白 的参与下，才有降解亚硝酸盐的酶活性，该酶分子量可能为40KDa，可能为二聚体，蛋白含血 红素C的活性中心，蛋白中同时含有铁和铜两元素。
【主权项】
1. 一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶的基因，其核苷酸序列如NO. 1所示。2. -种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶，其特征在于，由权利要求1所述基因编码的蛋 白质。3. 含有权利要求1所述蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒。4. 根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，该重组质粒中含组氨酸标签。5. -种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 以NCBI中蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因为模板，进行上下游引物设计， 设计的酶切位点为NcoI、SalI ; (2) 提取蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus) LJOl的DNA，并以此为模板，通过PCR技术 扩增蜡样芽孢杆菌LJOl亚硝酸盐还原酶的基因片段；所述蜡样芽孢杆菌LJOl的保藏编号 为 CGMCC NO. 9360 ; (3) 利用Ncol、Sail工具酶将扩增片段和质粒pET-32a(+)于37°C下分别切成具有两 个粘性末端的片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段，并用T4DNA连接酶连接，再转入重 组大肠杆菌中，利用抗生素氨苄青霉素进行筛选即获得阳性工程菌； (4) 将上述工程菌经诱导表达，采用亲和层析法纯化，即得到蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还 原酶。6. 根据权利5所述的方法，其特征在于，所述上游引物为5' -GATGCCATGGATGAGTTATGAAAAAGTAT-3'（NcoI)，下游引物为 5' -ACGCGTCGACCTAAGACGCTATTACTTCT-3' （Sail)。7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述诱导表达为加入诱导剂IPTG进 行诱导，且诱导浓度为〇. 1~I. 〇mm〇l/L。8. 权利要求2所述蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶在降解亚硝酸盐中的应用，其特征在 于，在降解过程中需加入电子供体蛋白。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的电子供体蛋白为细胞色素c或从蜡 样芽孢杆菌LJOl中提取得到的电子供体蛋白，其添加量为亚硝酸盐还原酶的1/5~1/15。
【专利摘要】本发明公开了一种蜡样芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶及基因和应用，本发明是利用PCR技术将蜡样芽孢杆菌LJ01中的亚硝酸盐还原酶(简称NiR)基因进行克隆并在大肠杆菌中进行了诱导表达，通过对加IPTG诱导含空质粒BL21、不加IPTG诱导含重组质粒BL21以及加IPTG诱导含重组质粒BL21的细胞进行超声破碎提取粗酶液，对其进行SDS-PAGE检测重组蛋白的表达，利用亲和层析作用纯化得到高纯度的重组蛋白，解决了从蜡样芽孢杆菌中分离出纯度和含量较高NiR的难题。得到的大量的NiR重组蛋白可以用于食品中的亚硝酸盐的降解；也可用于非酸性环境中亚硝酸盐的降解及养殖水体中亚硝酸盐的降解。
【IPC分类】C12N15/53, C12N9/06, A23L1/015, C02F101/16, C12N15/70, C02F3/34
【公开号】CN105063066
【申请号】CN201510487484
【发明人】刘冬梅, 罗彤晖, 杨丹霞, 陈舒然, 黄智斌
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月10日