别是S.pombe)，Yarowia(特别是 Y.lypolytica)，所述真菌例如是Talaromyces。
[0034] 在最优选的实施方案中，N-保护的前体的发酵生产在微生物中进行，其中N-保护 的前体是体内形成的。优选地，根据本发明的N-保护的前体的形成是由任何合适的碳源生 物转化成N-保护的前体。
[0035] 用于发酵方法的碳源可尤其含有至少一种选自下组的化合物：一元醇、多元醇、羧 酸、一氧化碳、脂肪酸、甘油酯，包括任何所述化合物的混合物。合适的一元醇包括甲醇和乙 醇。合适的多元醇包括甘油和碳水化合物。合适的脂肪酸或甘油三酯可尤其以食用油的形 式提供，优选地为植物来源。
[0036] 特别地，可以使用碳水化合物，因为通常碳水化合物可从生物可更新来源如农产 品（优选地农业废料）中大量获得。优选地，使用选自下组的碳水化合物：葡萄糖、果糖、蔗 糖、乳糖、蔗二糖、淀粉、纤维素和半纤维素。尤其优选的是葡萄糖、包含葡萄糖的寡糖和包 含葡萄糖的多糖。
[0037] 另外，也可以使用氨基酸或其衍生物、谷氨酸或其衍生物和/或鸟氨酸或其衍生 物作为碳源。
[0038] 可以使用含有无机氮的化合物例如胺、铵盐、尿素、硝酸盐和亚硝酸盐，或含有有 机氮的化合物例如氨基酸或其衍生物，更特别地谷氨酸或其衍生物和/或鸟氨酸或其衍生 物，作为氮源。
[0039] 在本文中提及生物催化剂时，其可表示表达至少一种与生物催化功能相关的酶的 生物，或其可表示至少一种得自或源自生物的酶。生物可以是真核或原核的。特别地，生物 可选自动物（包括人）、植物、细菌、古细菌、酵母和真菌。
[0040] 在一个实施方案中，生物催化剂源自动物，特别地源自动物部分，例如肝、胰、脑、 肾、心或其他器官。动物可特别地选自哺乳动物的组，更特别地选自灵长类动物（如Homo sapiens)、Leporidae、Muridae、Suidae和Bovidae的组。
[0041] 作为生物催化剂来源的合适植物特别是选自Asplenium;Cucurbitaceae，特别是 Cucurbitaj^lJ^nCucurbitamoschataCl^jUhl^CucumisWercurialisj^lJ^nMercurialis perennis;Hydnocarpus;和Ceratonia组的植物。
[0042] 作为生物催化剂来源的合适细菌可特别选自Acinetobacter，Agrobacterium， Alcaligenes，Bacillus，Brevibacterium，Clostridium，Corynebacterium，Deinococcus， Enterobacter,Enterococcus,Erwinia,Escherichia,Geobacillus,Klebsiella, Lactobacillus，Lactococcus，Legionella，Mycobacterium，Neisseria，Nitrosomonas， Novosphingobium，Paracoccus，Proteus，Pseudomonas，Ralstonia，Rhodobacter， Rhodopseudomonas，Salmonella，Shigella，Staphylococcus，Streptococcus， Streptomyces，Thermus，Vibrio和Zymomonas的组。
[0043] 作为生物催化剂来源的合适古细菌可特别地选自Aeropyrum，Archaeoglobus， Halobacterium，Methanobacterium，Methanobrevibacter，Methanocaldococcus， Methanococcus，Methanopyrus，Methanosarcina，Methanosphaera，Pyrobaculum和 Thermoplasma的组。
[0044] 作为生物催化剂来源的合适真菌可特别地选自Aspergillus，Neurospora， Penicillium，Rhizopus和Trichoderma的组。
[0045] 作为生物催化剂来源的合适酵母可特别地选自Candida，Cytophagia，Hansenula， Humicola，Kluyveromyces，Mucor，Rhizoctonia，Saccharomyces和Yarrowia的组。
[0046] 本领域技术人员应当明白，在根据本发明的方法中可以利用具有合适活性的天然 存在的生物催化剂（野生型）或天然存在的生物催化剂的突变体。可以通过本领域技术人 员已知的生物学技术，例如分子进化或合理设计（rationaldesign)改进天然存在的生物 催化剂的特性。可例如通过使用本领域技术人员已知的诱变技术（随机诱变、定点诱变、定 向进化、基因重组等）修饰下述生物的编码DNA来制造野生型生物催化剂的突变体，所述生 物能够发挥生物催化剂的作用或者能够生产生物催化剂部分（如酶）。具体地，可以修饰 DNA，使其编码与野生型酶差异至少一个氨基酸的酶，使其编码与野生型相比包含一个或多 个氨基酸取代、缺失和/或插入的酶，或者使得突变体组合两个或更多亲本酶的序列，或者 影响合适的（宿主）细胞中藉此被修饰的DNA的表达。后者可以通过本领域技术人员已知 的方法如密码子优化或密码子对优化来实现，例如基于W02008/000632中所述方法。
[0047] 突变体生物催化剂可具有经改进的特性，例如关于一个或多个以下方面：底物选 择性、活性、稳定性、溶剂耐受性、pH谱、温度谱、底物谱、对抑制的敏感性、辅因子利用和底 物亲和力。可以通过应用例如合适的高通量筛选或选择方法，基于本领域技术人员已知的 这类选择方法，来鉴定具有改进的特性的突变体。
[0048] 涉及来自具体来源的生物催化剂（特别是酶）、来自供体生物但是实际上在（经遗 传修饰的）宿主生物中生产的重组生物催化剂（特别是酶）时，特定地旨在包括来自所述 第一生物的生物催化剂（特别是酶）。
[0049] 本发明上下文中任何生物催化步骤的反应条件可根据生物催化剂（特别是酶）的 已知条件、本文公开的信息和任选地一些常规实验来选择。
[0050] 使用的反应培养基的pH可以在宽泛的界限内选择，制药生物催化剂在所述pH条 件下有活性即可。可以使用碱性、中性或酸性条件，取决于生物催化剂和其它因素。当所述 方法包括使用微生物（例如用于表达催化本发明方法的酶）时，选择pH使得所述微生物 能够发挥其预期的一种或多种功能。在25°C下基本水性体系的情况下，特别可在低于中性 pH四个pH单位和高于中性pH两个pH单位的范围内选择pH，即在pH3和pH9之间选择。 如果水是唯一的溶剂或主要的溶剂（以总液体为基础>50wt. %，特别是>90wt. % )，则系 统被认为是水性的，其中例如小量的醇或另一种溶剂（以总液体为基础<50wt. %，特别是 <10wt. % )可以下述浓度溶解（例如作为碳源），所述浓度使得可以存在的微生物保持活 性。特别是在使用酵母和/或真菌的情况下，可优选酸性条件，特别是25 °C下基于基本水性 体系的pH可以在pH3到pH8的范围内。需要时可以使用酸和/或碱调节或者用合适的 酸和碱的组合缓冲pH。
[0051] 孵育条件可以在在广阔的界限内选择，只要生物催化剂显示足够的活性和/或生 长即可。这包括需氧、微需氧、限氧和厌氧的条件。
[0052] 厌氧条件在本文中被定义为下述条件：无任何氧，或其中生物催化剂（特别是微 生物）基本不消耗氧并且通常对应于少于5mmol/l.h的氧消耗，特别是小于2. 5mmol/l.h 的氧消耗，或小于lmm〇l/l.h的氧消耗。
[0053] 需氧条件是下述条件，其中对不受限制的生长而言足够水平的氧溶于培养基中， 能够支持至少10mm〇l/l.h、更优选地多于20mmol/l.h、进一步更优选地多于50mmol/l.h、 最优选地多于100mm〇l/l.h的氧消耗速率。
[0054] 限氧条件被定义为下述条件：其中氧消耗由从气体转移至液体的氧限制。限氧 条件的下限由厌氧条件的上限决定，即至少lmm〇l/l.h，特别是至少2. 5mmol/l.h，或至少 5mmol/l.h。限氧条件的上限由需氧条件的下限决定，即少于100mmol/l.h、少于50mmol/ 1.h、少于 20mmol/l.h或少于 10mmo1 /1.h〇
[0055] 条件是需氧、厌氧还是限氧取决于所述方法进行的条件，特别是进入气流的量和 组成、使用的设备的实际混合/质量转移特性、使用的微生物的类型和微生物密度。
[0056] 使用的温度不是关键性的，只要生物催化剂（特别是酶）显示大量活性即可。通 常，温度可以是至少〇°C，特别是至少15°C，更特别是至少20°C。想要的最大温度取决于生 物催化剂。通常这类最大温度是本领域已知的，例如在可商业获得的生物催化剂的情况下 在产品数据表中指出，或者可以基于公知常识和本文公开的信息常规地测定。温度通常是 90°C或更少，优选地是70°C或更少，特别是50°C或更少，更特别是40°C或更少。
[0057] 特别地，如果在宿主生物外进行生物催化反应，包含有机溶剂的反应培养基可以 以高浓度（例如大于50%，或大于90wt. % )使用（使用在包含有机溶剂的反应培养基中 保持足够活性的酶时）。
[0058] 在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于生产作为DAB的N-保护的前体的 N5-保护的鸟氨酸的生物催化方法。例如，N5-乙酰基鸟氨酸的制备可包含一个或多个以下 的被酶催化的反应：
[0059] 1)谷氨酸到N-乙酰基谷氨酸
[0060] 2)N-乙酰基谷氨酸到5-磷酸N-乙酰基谷氨酸
[0061] 3) 5-磷酸N-乙酰基-谷氨酸到N-乙酰基-谷氨酸半醛
[0062] 4)N-乙酰基-谷氨酸半醛到N2-乙酰基-鸟氨酸
[0063] 5)N2-乙酰基-鸟氨酸到N5-乙酰基-鸟氨酸
[0064] 反应1)可由选自酰基转移酶（EC2. 3. 1)组、优选地选自氨基酸N-乙酰基转移酶 (EC2. 3. 1. 1)组的酶催化。优选地，酶对作为乙酰基供体的乙酰基-CoA和作为乙酰基受体 的谷氨酸而言是特异性的。氨基酸N-乙酰基转移酶可源自原核生物或真核生物。能够催 化反应1)的示范性蛋白质在表1中给出，并给出它们在Uniprot数据库的登记号及其来源 (微）生物。
[0065] 反应2)可由选自乙酰基-谷氨酸激酶（EC2. 7. 2. 8)组的酶催化。所述酶可使用 ATP作为辅因子。乙酰基-谷氨酸激酶可源自原核生物或真核生物。能够催化反应2)的示 范性蛋白质在表1中给出，并给出它们在Uniprot的登记号及其来源（微）生物。
[0066] 反应3)可由选自氧化还原酶（EC1. 2. 1)组，优选地选自N-乙酰基-y-谷氨酰 基-磷酸还原酶（EC1. 2. 1. 38)组的酶催化。所述酶可使用NADH或NADPH作为辅因子。 N-乙酰基-y-谷氨酰基-磷酸还原酶可源自原核生物或真核生物。能够催化反应3)的示 范性蛋白质在表1中给出，并给出它们在Uniprot的登记号及其来源（微）生物。
[0067] 反应4可由选自转氨酶（EC2.6. 1)组、优选地选自乙酰基鸟氨酸转氨酶（EC 2. 6. 1.11)组的酶催化。乙酰基鸟氨酸转氨酶可使用谷氨酸作为氨基供体。乙酰基鸟氨酸 转氨酶可源自原核生物或真核生物。能够催化反应4)的示范性蛋白质在表1中给出，并给 出它们在Uniprot的登记号及其来源（微）生物。
[0068] 反应5)可由N-酰基转移酶如谷氨酸N-乙酰基转移酶（EC2. 3. 1. 35)催化。
[0069] 谷氨酸可通过本领域公知的谷氨酸生物合成反应源自合适的碳源。优选地，使用 累积大量谷氨酸的微生物，例如Corynebacteriumglutamicum。用于（例如通过遗传工程） 改进谷氨酸生产的方法，是本领域公知的（KimuraE.，AdvBiochemEngBiotechnol. 2003; 79:37-57)。
[0070] 或者，N5-乙酰基鸟氨酸的制备可包括一个或多个以下由酶催化的反应：
[0071] 6)谷氨酸到N-乙酰基谷氨酸
[0072] 7)N-乙酰基-谷氨酸加鸟氨酸到N2-乙酰基-鸟氨酸
[0073] 8)N2-乙酰基-鸟氨酸到N5-乙酰基-鸟氨酸
[0074] 表1 :用于反应步骤1 - 8的酶
[0075]
[0076] 反应6)与反应1)相同，并且可以由相同类型的酶催化。
[0077] 反应7)可由选自酰基转移酶（EC2. 3. 1)组、优选地谷氨酸N-乙酰基转移酶（EC 2. 3. 1. 35)组的酶催化。优选地，酶使用鸟氨酸作为乙酰基受体，从而产生谷氨酸和N-乙 酰基-鸟氨酸作为反应产物。谷氨酸N-乙酰基转移酶可具有针对N-乙酰基-谷氨酸的水 解活性，产生谷氨酸和乙酸作为水解产物。优选地，使用的酶不具有可检出的水解活性；或 者可以改造野生型酶，使得与野生型酶相比水解活性大幅降低。谷氨酸N-乙酰基转移酶可 源自原核生物或真核生物。能够催化反应7)的示范性蛋白质在表1中给出，并给出它们在 Uniprot的登记号及其来源（微）生物。
[0078]反应8)与反应5相同，并可由相同