的PCR产物克隆进pBAD/Myc-His-DEST表达载体中。通过DNA测序 验证通过PCR克隆的基因序列。通过这种方式，获得表达载体pBAD-Pae-_gi9946143_AT、 pBAD-Pae_gi9951072_AT和pBAD-Pde_AT_ZP00628577。通过用pBAD构建体转化化学感受 态E.coliT0P10 (Invitrogen)，获得相应的表达菌株。
[0181]培养用于蛋白质表达的E.coli
[0182] 在具有含0. 02% (w/v)L-阿拉伯糖的940y1培养基的96-深孔平板中进行小规 模培养。通过用96孔印模（KUhner，Birsfelden，瑞士）将细胞从冷冻菌种培养物转移，进 行接种。在定轨摇床（300rpm，5cm振幅）上于25°C下将平板孵育48小时。典型地，达到 2-4 的OD620nm。
[0183]细朐裂解物的制备
[0184] 裂解缓冲液的制备
[0185] 裂解缓冲液含有表4中所列成分：
[0186]表 4
[0187]
[0188] 使用前即刻新鲜制备溶液。
[0189] 通过裂解制备无细胞提取物
[0190] 通过离心收获来自小规模培养（见前一段）的细胞，并弃去上清液。将离心期间 形成的细胞沉淀物在_20°C下冷冻至少16小时，然后在冰上融化。向每个孔中添加500y1 新鲜制备的裂解缓冲液，通过将平板剧烈振荡2-5分钟重悬细胞。为了实现裂解，将平板在 室温下孵育30分钟。为了去除细胞碎片，将平板在4°C和6000g下离心20分钟。将上清液 转移至新鲜平板上，并置于冰上，直至进一步使用。
[0191] 通过超声处理制备无细胞提取物
[0192] 通过离心收获来自中等规模培养（见前一段）的细胞，并弃去上清液。对0. 5g湿 细胞沉淀物添加lml磷酸钾缓冲液pH7,并通过剧烈振荡重悬细胞。为了实现裂解，将细胞 超声处理20分钟。为了去除细胞碎片，将裂解物在4°C和6000g下离心20分钟。将上清液 转移至新鲜管中，并冷冻于-20 °C下直至进一步使用。
[0193]将N-乙酰基-4-氨基丁醛牛物转化成N-乙酰基-DAB
[0194] 筛选条件
[0195] 将所有酶重悬于lOOmM磷酸钾缓冲液pH7. 5中至100y1的终体积。通过添加含 有胺供体（L-丙氨酸或（S) -a甲基苄胺）和辅因子（PLP)的150y1储存溶液起始酶促反 应。250y1反应混合物中的最终浓度为：N-乙酰基-氨基丁醛（70mM)、胺供体（140mM)、 PLP(12. 5mM)。单独测试两种胺供体。将反应混合物在28°C下孵育过夜（16. 5和16小时）， 同时在IKA定轨摇床上于560rpm下摇动。孵育后终止反应混合物，并通过添加750y1含 有0. 2%甲酸的乙腈的60%稀释液来稀释。将微量滴定板在3500rpm下离心20分钟。通 过LC-MS分析（见ResolveJob2009-02-00649)进行分析。
[0196] 分析方法：
[0197] 使用job2009-01-00306中所述的分析方法，通过LC-MS分析总计148个样 品。检测界限；线性范围：对胺供体L-丙氨酸而言为0^111〇1/1- 550 ^111〇1/1，对胺供体 (S)_a-甲基节胺而言为 〇ymol/L- 280umol/L。
[0198]将N-乙酰基-4-氨基丁醛牛物转化成N-乙酰基-DAB的结果
[0199] 针对N-乙酰基-4-氨基丁醛成为N-乙酰基-DAB的途径，筛选总计148种转氨酶。 通过LC-MS，针对转化分析所有样品。基于N-乙酰基-DAB的形成计算转化。使用L-丙氨 酸作为胺供体时，发现总计31个氨基转移酶命中（hits) (>2%转化）。使用（S)-a-甲基 苄胺作为胺供体时，发现其中20个也是阳性的。这些阳性命中中的五个列举于表5中。
[0200]表 5:
[0201] 在N-乙酰基-4-氨基丁醛生物成为N-乙酰基-DAB的生物转化中显示>2 %转化 的命中
[0202]
[0203]
[0204]N-乙酰基-DAB成为DAB的牛物转化
[0205] 筛选条件
[0206] 将所有酶重悬于lOOmM磷酸钾缓冲液pH7. 5中至100y1的终体积。通过添 加150y1磷酸钾缓冲液lOOmM中13. 33mg/mlN-乙酰基-DAB.HC1 (最终反应浓度8mg/ ml~48mMN-乙酰基-DAB)起始反应。将反应混合物在37°C下孵育过夜，同时在IKA定轨 摇床上于460rpm下摇动。孵育后终止反应混合物，并通过添加750y1H20中lOOmMHC104， pH1. 0来稀释。将微量滴定板在3500rpm下离心20分钟，并如下文所述通过HPLC-PCR-FL 分析DAB。
[0207]用于测宙DAB的HPLC-MS分析方法
[0208]样品制备:
[0209] 使用含有0. 2%甲酸的乙腈和水的混合物稀释样品。乙腈的百分比必须至少为 50%〇
[0210] LC条件:
[0211]
[0212]
[0213]
[0214]
[0215] 在所采用的条件下DAB在6. 3分钟洗脱。
[0216] N-乙酰基-DAB生物转化成DAB的结果
[0217] 从所测试的酶中进行的选择列于表6中，所述选择在N-乙酰基-DAB成为DAB的生 物转化中显示水解活性。这些酶中的一些也通过它们并入本专利申请的序列信息被表征。
[0218] 表6 :N_乙酰基-DAB成为DAB的水解
[0219]
[0220]
[0221] 结论
[0222] 发现大量水解酶可作为生物催化剂用于将N-乙酰基-DAB转化成DAB。
[0223] 可以通过例如4-氨基丁醛或鸟氨酸的酰化制备具有其他酰基-保护基的DAB的 N-保护的前体。例如，通过用甲酸中的乙酸酐酰化来引入甲酰保护基，或通过C2-C6羧酸酐 或酰氯的反应，分别引入N-乙酰基、N-丙酰基、N-丁酰基、N-戊酰基或N-己酰基保护基。
[0224] 预期这些DAB的N-保护的前体例如N-甲酰基-DAB和具有C3-C6酰基保护基的 更高的同源物能够通过上文所述的酶类似地转化。
[0225] N5-乙酰基-鸟氨酸成为N-乙酰基-DAB的牛物转化
[0226] 细胞培养和表达
[0227] 使用脱羧酶进行所述生物转化。大部分脱羧酶在E.coli中在标准条件下表达。
[0228]通过用带有pBAD-DEST_lysA、pBAD-DEST_kdcA、pBAD-DEST_kivD或pBAD-DEST_ kgd的E.coliToplO从甘油菌种接种5mlLBeart培养基制造预培养物。将预培养物在28°C下 孵育过夜。将0.5ml每种预培养物在50mlLBeal^^养基中稀释。将培养物在28°C下孵育， 直至达到0. 6的0D6。。（平均3-4小时后）。通过添加阿拉伯糖至0. 02 %的终浓度，诱导蛋白 质表达。在28°C下孵育过夜后收获细胞（10分钟，5000rpm，4°C)。为了用SDS-PAGE进行分 析，在诱导前、诱导后3小时和过夜时采取lml样品。使细胞形成沉淀物（5min，13,OOOrpm) 并将沉淀物储存于-20 °C下。
[0229] 培养两种鸟氨酸脱羧酶pBAD2_0DCE.coli DH5 a /LJ110,并在略微不同的条件下 表达。将主培养物培养至1. 5的0D62。，之后用50 yM IPTG诱导。所有其他条件与上文所述 相同。
[0230] 通过超声处理制备CFE
[0231] 将细胞沉淀物在冰上融化，并重悬于2倍体积的50mM磷酸钾（KPi)缓冲液pH7. 5 中。将细胞悬浮液超声处理10分钟，所述处理有10秒开启和闭合的脉冲。超声处理后通 过离心（20分钟，13, 200rpm，4°C)使细胞碎片形成沉淀物。使用SDS-PAGE分析测定表达 水平，并将CFE储存于-20 °C下。
[0232]
[0233] 所有N-Ac-鸟氨酸成为N-Ac-DAB的反应都在37°C下搅拌和孵育。在0、2、18、28 和44小时取样，并储存于-20°C下。为了进行分析，将500yl每种样品添加至500yl乙 腈中，并在最大速度下离心10分钟。在TLC上分析样品，用铵：甲醇（1:1)的洗脱液洗脱， 并用水合茚三酮喷雾染色。为了进行定量分析，根据下文所述的方法通过LC-MS-MS测量样 品。
[0234]用于测宙N-乙酰基-DAB的HPLC-MS分析方法
[0235] 样品制备:
[0236] 使用含有0. 2%甲酸的乙腈和水的混合物稀释样品。乙腈的百分比必须至少为 50%〇
[0237]在来自AppliedBiosystems的PESCIEXAPI2000LC-MS/MS上进行实验。
[0238]LC条件:
[0239]
[0242] 在所应用的条件下N-Ac-DAB在4. 2分钟洗脱。
[0243]N5-乙酰基-鸟氨酸生物转化成N-乙酰基-DAB的结果
[0244] 对鸟氨酸成为DAB的转化而言，在TLC上分析结束时间样品（44小时）（图1)。
[0245] 用LC-MS-MS分析所有结束时间样品。显示高于对照样品水平至少3微摩尔数值 的这些样品展示于表8中。
[0246]表8牛物转化的LC-MS-MS结果
[0247]
【主权项】
1. 用于制备1，4-二氨基丁烷[DAB]的方法，所述方法涉及至少一个生物催化步骤，所 述生物催化步骤包括：以生物催化的方式生产至少一种DAB的N-保护的前体，以及随后将 所述DAB的N-保护的前体体外转化成DAB。2. 用于制备DAB的方法，所述方法涉及至少一个生物催化步骤，并且包括以下步骤： a) 以生物催化的方式制备DAB的N-保护的前体，得到含有所述DAB的N-保护的前体 的生物催化反应混合物， b) 从所述生物催化反应混合物中回收所述N-保护的前体， c) 将所述N-保护的前体转化成DAB。3. 根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中所述DAB的N-保护的前体选自由N5-保 护的鸟氨酸、N-保护的DAB和N-保护的4-氨基丁醛组成的组。4. 根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中所述至少一种DAB的N-保护的前体选 自由N5-乙酰基鸟氨酸、N-乙酰基DAB和N-乙酰基4-氨基丁醛组成的组。5. 根据权利要求1或2任一项所述的方法，其中所述生物催化步骤是发酵步骤。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述发酵步骤在单细胞宿主中发生。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述发酵步骤在选自由动物细胞、植物细胞、细 菌、古细菌、酵母和真菌组成的组的宿主细胞中发生。8. 根据权利要求2所述的方法，其中从所述生物催化反应混合物中对所述N-保护的前 体的回收通过至少一个选自下组的步骤进行，所述组由过滤、沉降、结晶、亲和层析、尺寸排 除色谱、膜分离和蒸发组成。9. 根据权利要求2所述的方法，其中所述N-保护的前体转化成DAB的转化步骤c)涉 及至少一个酶处理或化学处理步骤。10. 根据权利要求1到9中任一项的用于制备DAB的方法，其中使用水解酶将所述N-保 护的DAB转化成DAB。11. 根据权利要求10所述的方法，其中使用下述水解酶，所述水解酶选自由羧酸酯水 解酶、硫酯水解酶、脂肪酶和肽酶组成的组，尤其选自脂肪酶和肽酶。12. 根据权利要求10所述的方法，其中所述水解酶是下述水解酶，所述水解酶选自由 丝氨酸型羧肽酶、金属羧肽酶、半胱氨酸型羧肽酶、丝氨酸内肽酶、半胱氨酸内肽酶、天冬氨 酸内肽酶和金属内肽酶组成的组，尤其选自丝氨酸内肽酶。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述丝氨酸内肽酶是枯草杆菌蛋白酶，优选地 是枯草杆菌蛋白酶Carlsberg。
【专利摘要】本发明涉及用于通过N-酰基或N-胍基保护的1,4-丁二胺前体制备1,4-丁二胺的方法。根据本发明的方法涉及至少一个生物催化步骤，其包括以生物催化的方式生产至少一种DAB的N-保护的前体。本发明还涉及用于制备DAB的方法，所述方法涉及至少一个生物催化步骤，并且包括步骤a)以生物催化的方式制备DAB的N-保护的前体，得到含有DAB的N-保护的前体的生物催化反应混合物，b)从生物催化反应混合物中回收N-保护的前体，和c)将N-保护的前体转化成DAB。更特别地，本发明涉及用于制备DAB的方法，其中至少DAB的N-保护的前体选自由N5-保护的鸟氨酸、N-保护的DAB和N-保护的4-氨基丁醛组成的组。
【IPC分类】C12P13/00
【公开号】CN105132486
【申请号】CN201510437160
【发明人】吴亮, 彼托纳拉·凯瑟琳娜·拉伊马克斯-弗兰肯
【申请人】帝斯曼知识产权资产管理有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2010年7月20日
【公告号】CA2768614A1, CN102471789A, CN102471789B, EP2456879A1, US8999680, US20120190087, WO2011009859A1