法进行详细说明。
[0040] 实施例1 :本发明所述培养方法
[0041] 1、单个核细胞（PBMC)的分离：
[0042] 将抗凝管中的外周血转移到离心管中，400-500离心5-10min，离心结束后将下层 血细胞转移到50mL离心管中，加入两倍体积的生理盐水进行稀释；
[0043] 另取一支新的sepmate离心管（购自STEMCELL公司），加入Ficoll淋巴细胞分 离液（购自STEMCELL公司）12ml，将稀释后的血细胞转移到sepmate离心管，600_800g离 心 15_20min;
[0044] 离心后，将上层液体倒出，加入生理盐水进行洗涤1次；
[0045] 离心，去上清，即得到PBMC。
[0046] 2、B淋巴细胞的分选、维持和刺激
[0047] 用⑶19分选试剂盒（购自STEMCELL公司）将B淋巴细胞从上述单个核细胞分 选出来；
[0048] 用含有15ng/ml的Flt3因子和30U/ml的IL-2的X-VIV0 15培养基重悬细胞，将 B淋巴细胞培在5 %的二氧化碳浓度，95 %的湿度的37°C培养箱中维持培养1天；
[0049] 第2天加入肿瘤抗原刺激B淋巴细胞36-48小时。
[0050] 3、CIK细胞的诱导培养
[0051] 将分选后的单个核细胞用X-VIV0 15培养基重悬，按照1X106-2X106/ml的密度 接种在细胞培养瓶中，并加入1000U/mLIFN-λ，在37°C、5%二氧化碳的培养箱诱导培养 CIK细胞；
[0052] 第 2 天补加 100U/mL的IL-1a、30ng/ml的 0KT-3 以及 550U/ml的IL-2 溶液继续 培养；
[0053] 4、B淋巴细胞和CIK细胞的共培养
[0054] 将CIK细胞和经过肿瘤抗原刺激后的B细胞按照10:1的共培养比例在5%的二氧 化碳浓度，95%的湿度的37°C培养箱中共培养，并补加含600U/ml的IL-2的X-VIV0 15培 养基共培养14天，其中CIK细胞密度为1X106/ml，定期在导致倒置显微镜下观察细胞的状 态，每隔1-2天补充含IL-2的X-VIV0 15培养基。
[0055] 实施例2 :现有技术共培养方法
[0056] 1、单个核细胞（PBMC)的分离：
[0057] 将抗凝管中的外周血转移到离心管中，400-500离心5-10min，离心结束后将下层 血细胞转移到50mL离心管中，加入两倍体积的生理盐水进行稀释；
[0058] 另取一支新的离心管，加入Ficoll淋巴细胞分离液12ml，将稀释后的血细胞转移 到离心管，600_800g离心15_20min;
[0059] 离心后，将上层液体倒出，加入生理盐水进行洗涤1次；
[0060] 离心，去上清，即得到PBMC。
[0061] 2、DC细胞的培养
[0062] 将PBMC按照1X10%1接种到细胞培养瓶中进行培养1-4小时；
[0063] 将悬浮细胞吸出到一个新的培养瓶中，剩余的贴壁细胞加入XVIV015培养基，以 及100-1000U/ml的GM-CSF和100-1000U/ml的IL-4溶液诱导培养成DC细胞；
[0064] 每隔 2 天补液一次和补加 100-1000U/ml的GM-CSF和 100-1000U/ml的IL-4 溶 液；
[0065] 第6天加入肿瘤坏死因子（TNF- α )刺激DC细胞的成熟。
[0066] 3、CIK细胞的诱导培养
[0067] 将悬浮细胞用X-VIV0 15培养基重悬，按照1X106-2X106/ml的密度接种在细胞 培养瓶中，并加入500-1500U/mLIFN-λ，在37°C、5%二氧化碳的培养箱诱导培养CIK细 胞；
[0068]第 2 天补加 50-150U/mL的IL-1a、10-50ng/ml的 0KT-3 以及 100-1000U/ml的 IL-2溶液继续培养；
[0069] 4、DC细胞和CIK细胞的共培养
[0070] 第7天将DC细胞和CIK细胞在5%的二氧化碳浓度，95%的湿度的37°C培养箱共 培养，并补加含l〇〇-l〇〇〇U/ml的IL-2溶液的X-VIV0 15培养基；
[0071] 定期在导致倒置显微镜下观察细胞的状态，每隔1-2天对细胞进行补液；两者细 胞共培养14天。
[0072] 实施例3 :本发明所述培养方法
[0073] 1、单个核细胞（PBMC)的分离：
[0074] 将抗凝管中的外周血转移到离心管中，400-500离心5-10min，离心结束后将下层 血细胞转移到50mL离心管中，加入两倍体积的生理盐水进行稀释；
[0075] 另取一支新的sepmate离心管（购自STEMCELL公司），加入Ficoll淋巴细胞分 离液（购自STEMCELL公司）12ml，将稀释后的血细胞转移到sepmate离心管，600_800g离 心 15_20min;
[0076] 离心后，将上层液体倒出，加入生理盐水进行洗涤1次；
[0077] 离心，去上清，即得到PBMC。
[0078] 2、B淋巴细胞的分选、维持和刺激
[0079] 用⑶19分选试剂盒（购自STEMCELL公司）将B淋巴细胞从上述单个核细胞分 选出来；
[0080] 用含有10ng/ml的Flt3因子和50U/ml的IL-2的X-VIV0 15培养基重悬细胞，将 B淋巴细胞培在5 %的二氧化碳浓度，95 %的湿度的37°C培养箱中维持培养1天；
[0081] 第2天加入肿瘤抗原刺激B淋巴细胞36-48小时。
[0082] 3、CIK细胞的诱导培养
[0083] 将分选后的单个核细胞用X-VIV0 15培养基重悬，按照IX106-2X106/ml的密 度接种在细胞培养瓶中，并加入500U/mLIFN-λ，在37°C、5%二氧化碳的培养箱诱导培养 CIK细胞；
[0084] 第 2 天补加 150U/mL的IL-1a、l〇ng/ml的 0KT-3 以及 1000U/ml的IL-2 溶液继 续培养；
[0085] 4、B淋巴细胞和CIK细胞的共培养
[0086]将CIK细胞和经过肿瘤抗原刺激后的B细胞按照10:1的共培养比例在5%的二 氧化碳浓度，95%的湿度的37°C培养箱中共培养，并补加含1000U/ml的IL-2的X-VIV0 15 培养基共培养14天，其中共培养CIK细胞密度为1X106/ml，定期在导致倒置显微镜下观察 细胞的状态，每隔1-2天补充含IL-2的X-VIV0 15培养基。
[0087] 实施例4 :本发明所述培养方法
[0088] 1、单个核细胞（PBMC)的分离：
[0089] 将抗凝管中的外周血转移到离心管中，400-500离心5-10min，离心结束后将下层 血细胞转移到50mL离心管中，加入两倍体积的生理盐水进行稀释；
[0090] 另取一支新的sepmate离心管（购自STEMCELL公司），加入Ficoll淋巴细胞分 离液（购自STEMCELL公司）12ml，将稀释后的血细胞转移到sepmate离心管，600_800g离 心 15_20min;
[0091] 离心后，将上层液体倒出，加入生理盐水进行洗涤1次；
[0092] 离心，去上清，即得到PBMC。
[0093] 2、B淋巴细胞的分选、维持和刺激
[0094] 用⑶19分选试剂盒（购自STEMCELL公司）将B淋巴细胞从上述单个核细胞分 选出来；
[0095] 用含有20ng/ml的Flt3因子和10U/ml的IL-2的X-VIV0 15培养基重悬细胞，将 B淋巴细胞培在5 %的二氧化碳浓度，95 %的湿度的37°C培养箱中维持培养1天；
[0096] 第2天加入肿瘤抗原刺激B淋巴细胞36-48小时。
[0097] 3、CIK细胞的诱导培养
[0098] 将分选后的单个核细胞用X-VIV0 15培养基重悬，按照1X106-2X106/ml的密度 接种在细胞培养瓶中，并加入1500U/mLIFN-λ，在37 °C、5 %二氧化碳的培养箱诱导培养 CIK细胞；
[0099] 第 2 天补加 50U/mL的IL-1a、50ng/ml的 0KT-3 以及 100U/ml的IL-2 溶液继续 培养；
[0100] 4、B淋巴细胞和CIK细胞的共培养
[0101] 将CIK细胞和经过肿瘤抗原刺激后的B细胞按照10:1的共培养比例在5%的二氧 化碳浓度，95%的湿度的37°C培养箱中共培养，并补加含100U/ml的IL-2的X-VIV0 15培 养基共培养14天，其中共培养CIK细胞密度为1X106/ml，定期在导致倒置显微镜下观察细 胞的状态，每隔1-2天补充含IL-2的X-VIV0 15培养基。
[0102] 实施例5 :CIK细胞的流式检测（检测⑶3+⑶56+)
[0103] 本发明共培养方法：实施例1 ;
[0104] 现有技术共培养方法：同实施例2 ;
[0105] 流式检测步骤：
[0106] 从共培养后的细胞中取1X106个CIK细胞，250g离心5min去上清；用含10%FBS 的PBS溶液清洗2次；避光加入⑶3、⑶56抗体2. 5μL室温孵育30min;用含10%FBS的 PBS溶液清洗2次；用500mLRPMI1640培养基重悬细胞并过滤，然后滤液上流式细胞仪进 行检测。结果见图1。
[0107] 由图1可知，本发明所述方法中效应细胞（⑶3+⑶56+)的比例为29. 6 %，现有技术 中效应细胞的比例为