16. 6%，明显较低。此外，将实施例3和实施例4进行相同的流式检 测，结果依然显示CIK效应细胞⑶3+⑶56+的比例显著高于现有技术共培养方法。
[0108] 实施例6 :CIK细胞杀伤活性检测
[0109] 现有技术共培养方法：同实施例2 ;
[0110] 杀伤活性检测步骤：
[0111] 本实施例中使用的细胞裂解液为9%1^切11乂-100，购自？1?01^64;底物液为 SunstrateMix，购自PR0MEGA;终止液为IMaceticacid。
[0112] 1)铺板时各实验孔和对照设置如下：
[0113] 实验孔：按效靶比40:1、20:1和10:1进行靶细胞（K562)和效应细胞（CIK细胞） 的铺板。其中，CIK细胞的浓度分别为4X106/mL，2X106/mL，1X106/mL，每孔100μL，每组 3个复孔；Κ562浓度为1X105/mL，每孔100μL，每组3个复孔。
[0114] 效应细胞自然释放孔：4\106/1^，2\10 6/1^，1\106/1^，每孔10(^1^，每组3个复 孔，每孔加入100μL培养基。
[0115]靶细胞最大释放孔：1X105/mL的靶细胞，每孔100μL，每组3个复孔，每孔加入 100μL培养基，于37°C、5 %二氧化碳培养箱孵育前45min每孔加入20μL细胞裂解液。
[0116]靶细胞自然释放孔：1X105/mL的靶细胞，每孔100μL，每组3个复孔，每孔加入 100μL培养基。
[0117] 培养液空白对照：每孔200μL培养液，每组3个复孔。
[0118] 体积纠正对照：每孔200yL培养液，每组3个复孔，于37°C、5%二氧化碳培养箱 孵育前45min每孔加入20μL细胞裂解液。
[0119] 2)铺板后将培养板250g离心4min，置于37°C、5%二氧化碳培养箱孵育4h。在培 养结束前45min，取出培养板，在靶细胞最大释放组和体积纠正组每孔加入20μL细胞裂解 液，250g离心4min，继续培养45min后取出。
[0120] 3)进行LDH(乳酸脱氢酶）测定，具体步骤如下：250g离心4min，每孔吸出50μL 上清转移到另一新的96孔板中，每孔加底物溶液50μL，室温避光孵育30min。每孔加入 50μL终止液，用振荡器将色素颗粒打散，测定490波长处的吸光度值。
[0121] 4)试验组、靶细胞LDH自然释放组和效应细胞LDH自然释放组的吸光度均值减去 培养液空白对照组吸光度值均值，获得校正值。靶细胞LDH最大释放组的吸光度均值减去 体积纠正组吸光度值均值，获得校正值。
[0122] 杀伤活性按如下公式计算：
[0123] 活性=(A-E-T)ATmax-T)X100 %
[0124] A:试验组吸光度值校正值；
[0125] E:效应细胞自然释放孔吸光度值校正值；
[0126] T:祀细胞自然释放孔吸光度值校正值；
[0127] Tmax:靶细胞最大释放组吸光度值校正值。
[0128] 结果见表1。
[0129]表1CIK细胞对K562细胞的杀伤活性检测
[0130]
[0131] 由表1可知，在杀伤K562时，本发明方法诱导的CIK细胞比现有方法诱导的CIK 细胞的杀伤效果更好，差异较明显。
[0132] 实施例7 :CIK细胞分泌的细胞因子含量的检测（ELASA法定量检测IFN-γ和IL-2 含量）
[0133] 本发明共培养方法：实施例1;
[0134] 现有技术共培养方法：同实施例2 ;
[0135] 细胞因子含量检测步骤：
[0136] 将CIK细胞培养后的细胞培养液收集起来进行浓缩，为实验品；分别将IFN-γ和 IL-2标准品溶解，分别设置了 5个浓度，分别是10μg/ml，20μg/ml，30μg/ml、40μg/ml及 50μg/ml;从已恢复到室温的密封袋中取出实验所需板条；
[0137] 留空白孔，提前30min制备生物素化抗体工作液，于10°C~35°C下避光放置；
[0138] 分别将实验品或不同浓度的标准品（0μg/ml孔加试剂稀释液）加入相应孔中， 100μ1/孔，用封板胶纸封住反应孔，37°C孵箱孵育90min，洗板4次：
[0139] 除空白孔外，加入酶结合物工作液，100μ1/孔。用胶纸封住反应孔，于37°C孵箱 避光孵育60min，洗板4次；
[0140] 除空白孔外，加入酶结合物工作液，100μ1/孔。用胶纸封住反应孔，于37°C孵箱 避光孵育30min，洗板4次；
[0141] 加入显色底物，100μ1/孔，于37°C孵箱避光孵育15min;加入终止液，100μ1/孔， 混匀后检测其吸光度值（od45。值）。
[0142] 标准品吸光度值曲线分别参见图2和图3,实施例1和实施例2中细胞培养液所测 IFN-γ的0D45。值分别为1. 22和1. 02,根据IFN-γ标准品的吸光度值曲线，可知IFN-γ标 准品的浓度与吸光度值成线性关系，其先线性曲线为：Υ= 〇. 047Χ+0. 29,根据曲线图，从而 可计算出本发明和现有技术的中的TGF-β的含量分别为19. 78μg/ml和15. 53μg/ml。
[0143] 实施例1和实施例2中细胞培养液所测IL-2的0D45。值分别为1. 386和1. 054,根 据IL-2标准品的吸光度值曲线，可知IL-10标准品的浓度与吸光度值成线性关系，其先线 性曲线为：Y= 0. 11X+0. 8,根据曲线图，从而可计算出本发明和现有技术的中的IL-2的含 量分别为 11. 31μg/ml和 8. 426μg/ml。
[0144] 此外，将实施例3-实施例4的细胞培养液进行同样的检测，结果显示，IFN-γ含 量均高于18μg/ml，IL-2的含量均高于10μg/ml。表明本发明方法诱导出的CIK细胞分 泌IFN-γ的能力和分泌IL-2的能力更高。
[0145] 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对 于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行 若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种CIK细胞的培养方法，其特征在于，包括： 步骤1、将B细胞用含有Flt3因子和IL-2的免疫细胞培养基重悬，然后加入肿瘤抗原 刺激B细胞； 步骤2、将CIK细胞和步骤1的经过肿瘤抗原刺激后的B细胞共培养，并补加含IL-2的 免疫细胞培养基共培养，定期补充含IL-2的免疫细胞培养基。2. 根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述B细胞由单个核细胞通过CD19分 选试剂盒分选出。3. 根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，所述CIK细胞由单个核细胞诱导培养获 得。4. 根据权利要求3所述培养方法，其特征在于，将单个核细胞用X-VIV015培养基重 悬，按照1X106-2X10%1的密度接种在细胞培养瓶中，并加入500-1500U/mLIFN-λ，在 37°C、5%二氧化碳的培养箱诱导培养CIK细胞； 第 2 天补加 50-150U/mL的IL-1a、10-50ng/ml的 0KT-3 以及 100-1000U/ml的IL-2 溶液继续培养，整个CIK细胞的诱导培养过程为14天。5. 根据权利要求2-4任意一项所述培养方法，其特征在于，所述单个核细胞通过以下 方法获得： 外周血离心收集下层血细胞加生理盐水稀释，加入淋巴分离液后离心，弃上层液体，加 水生理盐水洗涤，再次离心后去上清，获得单个核细胞。6. 根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，步骤1为： 将B细胞用含有Flt3因子和IL-2的免疫细胞培养基重悬并在5 %的二氧化碳浓度， 95%的湿度的37°C培养箱中维持培养1天，然后加入肿瘤抗原刺激B细胞36-48h。7. 根据权利要求1或6所述培养方法，其特征在于，步骤1所述Flt3因子的浓度为 10-20ng/ml，IL-2 的浓度为 10-50U/ml。8. 根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，步骤2所述CIK细胞和B细胞的体积比 为 10:1〇9. 根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，步骤2所述共培养为在在5%的二氧化 碳浓度，95%的湿度的37°C培养箱中共培养14天。10. 根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，步骤2所述共培养中CIK细胞的密度 为lX106/ml〇11. 根据权利要求1所述培养方法，其特征在于，步骤2所述IL-2浓度为100-1000U/ ml〇12. 根据权利要求1或6所述培养方法，其特征在于，所述免疫细胞培养基为X-VIV0 15培养基。 13. B细胞在培养CIK细胞中的应用。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，公开了一种CIK细胞的培养方法。本发明所述培养方法将B细胞用含有Flt3因子和IL-2的免疫细胞培养基重悬，然后加入肿瘤抗原刺激B细胞；将CIK细胞和经过肿瘤抗原刺激后的B细胞共培养，并补加含IL-2的免疫细胞培养基共培养，定期补充含IL-2的免疫细胞培养基。本发明选择B淋巴细胞替代传统的DC作为和CIK细胞共培养的细胞，通过B细胞和CIK细胞之间的相互作用促进CIK细胞增殖和杀伤活性的提高，同时又避免了DC体外扩增培养和添加多种细胞因子和抗体的复杂操作，整体工艺得到简化，相比现有方法更加具有优势。
【IPC分类】C12N5/0783
【公开号】CN105349489
【申请号】CN201510896888
【发明人】陈海佳, 王一飞, 葛啸虎, 罗二梅, 张维敏
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月7日