，同时加 入10μ1的步骤（二）中变性后的PCR产物，混匀后于37°C反应15min。
[0185](四）后处理
[0186] 将经步骤（三）中一步反应后的负载有金属膜的固相支持物转入后处理液中洗涤 3次，每次洗涤5min。
[0187] (五）显色反应
[0188] 5. 1配制显色溶液：在显色缓冲液中分别加入底物1和底物2各33μ1，配 制成 10ml组分如下所示的显色溶液：ΡΗ9. 5、0.lmol/LTris、0.lmol/LNaCl、50mM MgC120.33mg/mlNBT和 0.17mg/mlBCIP，余量为水。
[0189] 5. 2显色反应：将经步骤（四）中后处理的环烯烃共聚物塑料片表面负载的银膜 浸没在上述步骤5. 1中配制好的显色溶液中，显色5~lOmin，观察显色结果。
[0190] 本实施例的显色结果如图1所示。
[0191] 实施例8
[0192]同实施例7,不同之处在于利用实施例2的试剂盒对临床样品进行检测，其他条件 保持不变。
[0193] 本实施例的显色结果如图2所示。
[0194] 实施例9
[0195]同实施例7,不同之处在于利用实施例3的试剂盒对临床样品进行检测，其他条件 保持不变。
[0196] 本实施例的显色结果如图3所示。
[0197] 实施例10
[0198]同实施例7,不同之处在于利用实施例4的试剂盒对临床样品进行检测，其他条件 保持不变。
[0199] 本实施例的显色结果如图4所示。
[0200] 实施例11
[0201]同实施例7,不同之处在于利用实施例5的试剂盒对临床样品进行检测，其他条件 保持不变。
[0202] 本实施例的显色结果如图5所示。
[0203] 实施例12
[0204] 同实施例7,不同之处在于利用实施例6的试剂盒对临床样品进行检测，其他条件 保持不变。
[0205] 本实施例的显色结果如图6所示。
[0206] 从图1~6可见，利用本发明的试剂盒检测一例结直肠癌患者的石蜡包埋组织样 本分离纯化的临床样本核酸结果可以看出：35G>A突变检测探针点呈阳性，35G>?'突变 检测探针点呈阴性，35G>C突变检测探针呈阴性，34G>A突变检测探针点呈阴性，34G> T突变检测探针点呈阴性，34G>C突变检测探针点呈阴性，37G>C突变检测探针点呈阴 性，38G>A突变检测探针点呈阴性，同时35位点野生型检测探针点也为阳性，所以判定该 例结直肠癌患者的K-ras基因外显子2中第12密码子发生了 35G>A突变。这是由于组 织核酸样本中含有K-ras基因的35G>A突变型，所以35G>A突变检测探针为阳性，同时 该组织中还含有人体正常未癌变的组织，因此35位点野生型检测探针也为阳性。此外，阳 性对照探针显示阳性，阴性对照探针显示阴性，表明整个检测过程正常，实验结果可信。
[0207] 由此可见，本发明的试剂盒在金属膜表面上实现了核酸杂交过程与碱性磷酸酶联 过程合二为一进行，从而可以在金属膜表面直接形成碱性磷酸酶标记核酸杂交体的偶联 物。本发明的试剂盒通过一步反应后的显色反应，根据着色的深浅以及杂交信号与金属膜 的强烈色差，可以用肉眼快速判断核酸杂交的结果，提高了K-ras基因突变检测的灵敏度 与分辨能力，其中K-ras基因突变检测的灵敏度可以达到0. 05ng/μ1。此外，本发明的试剂 盒的使用操作步骤少，流程简单，检测快速，能够高度灵敏、高度特异地检测临床结直肠癌 组织样本核酸中K-ras基因的碱基突变，有利于指导临床直肠癌治疗的应用，具有重要的 临床应用价值。
[0208] 应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何 限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性 和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出 修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉 及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发 明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
【主权项】
1. 一种检测κ-ras基因突变的试剂盒，其包括PCR反应试剂、负载有金属膜的固相支持 物以及含有碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液；其中，所述PCR反应试剂包括用于扩增 靶核酸的生物素标记的引物，所述固相支持物的表面固定有用于检测K-ras基因突变的核 酸探针。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶标记链霉亲和素在杂 交液中的浓度为〇· 05~2μg/ml，优选0· 1~1. 5μg/ml，更优选0· 5~1. 2μg/ml。3. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述杂交液还包括锌离子、镁离子、 表面活性剂和阳离子型聚合物；其中，所述表面活性剂选自吐温和曲拉通，所述阳离子型聚 合物选自阳离子聚丙烯酰胺、多聚赖氨酸和聚合氯化铝。4. 根据权利要求1~3中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，在所述杂交液中，锌 离子为〇· 001~〇·lmol/L，镁离子为0· 001~0·lmol/L，表面活性剂占杂交液的0· 01~ 2% (v/v)，阳离子型聚合物占杂交液的0.01~0.5% (w/v);优选地，锌离子为0.005~ 0· 05mol/L，镁离子为0· 005~0· 05mol/L，表面活性剂占杂交液的0· 05~1 % (v/v)，阳离 子型聚合物占杂交液的〇. 05~0. 2 % (w/v)。5. 根据权利要求1~4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括 用于扩增K-ras基因的引物对；其中， 用于扩增K-ras基因的上游引物序列如SEQIDNO:1所示，5'端生物素标记； 用于扩增K-ras基因的下游引物序列如SEQIDN0:2所示。6. 根据权利要求1~4中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括 用于扩增K-ras基因的引物对；其中， 用于扩增K-ras基因的上游引物序列如SEQIDNO:3所示，5'端生物素标记； 用于扩增K-ras基因的下游引物序列如SEQIDN0:4所示。7. 根据权利要求1~6中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸探针包括： 用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上34G>A突变的核酸探针，其序列如 SEQIDNO:7 所示； 用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上34G>T突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO:8 所示； 用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上34G>C突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO:9 所示； 用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上35G>A突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO:10 所示； 用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上35G>T突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO:11 所示； 用于检测K-ras基因外显子2中第12密码子上35G>C突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO:12 所示； 用于检测K-ras基因外显子2中第13密码子上37G>C突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO:13 所示； 用于检测K-ras基因外显子2中第13密码子上38G>A突变的核酸探针，其序列如SEQIDNO:14 所示； 用于检测K-ras基因34、35、37和38位点野生型的核酸探针，其序列如SEQIDNO:15所示。8. 根据权利要求1~7中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括预处 理液和后处理液。9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述预处理液包括胱胺、脂肪醇聚氧乙 烯醚和异构醇；其中，所述脂肪醇聚氧乙烯醚选自C17~C19脂肪醇聚氧乙烯醚，所述异构醇 选自Q。~C13异构醇。10. 根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，在所述预处理液中，胱胺为3~ 20重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚为2~18重量份以及异构醇为0. 2~9重量份；优选地，胱 胺为5~10重量份，脂肪醇聚氧乙烯醚为3~12重量份以及异构醇为2~8重量份。11. 根据权利要求8~10中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述后处理液包括 Cs~C1S烷基葡萄糖苷，优选C9~C13烷基葡萄糖苷；所述烷基葡萄糖苷占后处理液的0. 5~ 5 % (w/v)，优选 1 ~4 % (w/v)。12. 根据权利要求8~11中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述后处理液的PH 为 9. 0 ~10. 0。13. 根据权利要求1~12中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述金属膜选自金 膜、银膜、铜膜和铝膜，优选银膜和铝膜；所述金属膜的厚度为l〇nm~100nm。14. 根据权利要求1~13中任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述固相支持物选自 硝酸纤维素膜、尼龙膜、硅片、载玻片和塑料片，优选为塑料片，更优选为环烯烃共聚物塑料 片。
【专利摘要】本发明公开了一种检测K-ras基因突变的试剂盒，其包括PCR反应试剂、负载有金属膜的固相支持物和含有碱性磷酸酶标记链霉亲和素的杂交液；其中，所述PCR反应试剂包括用于扩增靶核酸的生物素标记的引物，所述固相支持物的表面固定有用于检测K-ras基因突变的核酸探针。本发明的试剂盒是基于负载有金属膜的固相支持物开发的一种高灵敏的快速的反向杂交技术产品，试剂盒操作步骤少，流程简单，检测快速，能够用于高度灵敏、高度特异地检测临床结直肠癌组织样本核酸中K-ras基因的碱基突变，有利于指导临床直肠癌治疗的应用。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105349620
【申请号】CN201410415155
【发明人】杨华卫, 曾冀
【申请人】北京百诺奇生物科技有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2014年8月20日