获得。
[0113] 采用实施例2建立的多重PCR方法，PCR反应体系：20μ1 PCR反应体系中含有Qiagen Multiplex PCR Master Mix(Qiagen，Hilden，Germany)10yl，内对照质粒pMD18T_IAC 2X 104c〇pieS，模板2μ1。靶标特异性嵌合引物和通用引物（内参引物)按照实施例2中优化后的 工作终浓度，PCR扩增条件参见实施例2优化后的条件，即95°C预变性15min;95°C30s，60°C 90s，72°C60s，5 个循环；95°C30s，65°C90s，72°C60s，5 个循环；95°C30s，54°C90s，72°C60s， 30个循环;72°C延伸3min，热循环的升降温速度(ramp speed)设置为2.5°C/s。
[0114] 凝胶电泳：在QIAxcel设备上以DNA High Resolution kit(Qiagen，Hilden， Germany)进行片段分析。DNA Alignment Marker 15bp/600bp和size marker 25bp/500bp (Qiagen，Hi lden, Germany)用来确定片段大小。
[0115] 判定方法:根据条带的大小判断靶标是否存在。如果扩增内对照条带（145bp)与靶 标条带全部没有出现，体系中存在扩增抑制因素，为假阴性结果。
[0116] 检测结果:所有样本均有扩增条带出现（内参对照阳性和/或靶标基因阳性），未发 现扩增抑制因素。其中，
[0117] 15个样本出现191 bp条带，判定为ETEC阳性(sth阳性）；
[0118] 5个样本出现485bp条带，判定为ETEC阳性(elt阳性）；
[0119] 7个样本出现274bp条带，判定为EPEC阳性(eaeA阳性）；
[0120] 4个样本出现299bp条带，判定为EAEC阳性(aggR阳性）；
[0121] 3个样本出现225bp条带，判定为EHEC阳性(stxl阳性）；
[0122] 3个样本出现260bp条带，判定为EIEC或志贺氏菌阳性(virA阳性）；
[0123] 2个样本出现424bp条带，判定为空肠弯曲菌阳性(hipO阳性）；
[0124] 1个样本出现249bp条带，判定为沙门菌阳性(ompC阳性）。
[0125] 阳性样本中，有6个样本同时2-3个靶标基因阳性，分别为：
[0126] 2个样本ETEC阳性（sth&elt均阳性）；
[0127] 1个样本ETEC阳性（sth&elt阳性）和EPEC阳性(eaeA阳性）；
[0128] 1个样本EPEC阳性(eaeA阳性）、EIEC或志贺菌阳性(virA阳性）；
[0129] 1个样本EPEC阳性(eaeA阳性)和EAEC阳性(aggR阳性）；
[0130] 1个样本EAEC阳性(aggR阳性)和ETEC阳性(sth阳性）。
[0131] 对出现靶标基因扩增条带的样本，以现有技术已报道的上述各菌株的PCR体系进 行检测，发现结果一致。
[0132] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种同时检测12种腹泻病原菌的特异性嵌合引物对组合，其特征在于，含有以下引 物对： 用于检测肠致病性大肠杆菌（enteropathogenic Escherichia coli)EPEC的特异性嵌 合引物对的核苷酸序列如SEQIDN0.1-2、SEQIDN0.3-4所示； 用于检测肠产毒性大肠杆菌（enterotoxigenic E. coli)ETEC的特异性嵌合引物对的 核苷酸序列如SEQ ID N0.5-6、SEQ ID N0.7-8、SEQ ID N0.9-10所示； 用于检测肠出血性大肠杆菌(enterohaemorrhagic E. coli)EHEC的特异性嵌合引物对 的核苷酸序列如SEQIDN0.11-12、SEQIDN0.13-14所示； 用于检测肠聚集性大肠杆菌（enteroaggregativeE·coli)EAEC的特异性嵌合引物对 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 15-16所示； 用于检测肠侵袭性大肠杆菌（enteroinvasive E · coli )EIEC和志贺氏菌（Shigella spp)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO. 17-18所示； 用于检测沙门氏菌（Salmonella spp)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO .19-20所示； 用于检测空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如 SEQ ID NO .21-22所示； 用于检测结肠弯曲菌(Campylobacter coli)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO .23-24所示； 用于检测霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO .25-26所示； 用于检测副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的特异性嵌合引物对的核苷酸序列 如SEQ ID NO .27-28所示； 用于检测小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的特异性嵌合引物对的 核苷酸序列如SEQ ID NO.29-30所示。2. 权利要求1所述的特异性嵌合引物对组合在制备同时检测12种腹泻病原菌试剂盒中 的用途。3. -种内参引物在与权利要求1所述的特异性嵌合引物对组合配合使用在制备检测12 种腹泻病原菌试剂盒中的应用，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.31-32所示。4. 一种检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的特异性嵌合引物对组合和一对 内参引物，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.31-32所示。5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其工作程序包括以下步骤： (1) 提取待测样品的核酸； (2) 用权利要求1所述的特异性嵌合引物对组合和SEQ ID NO.31-32所示的内参引物， 对样品DNA进行单管一次多重PCR反应;PCR产物经电泳检测，可根据如下目的产物的片段大 小判断样品中含有的病原菌种类， 若PCR产物片段为369bp和/或274bp，则为大肠杆菌EPEC; 若PCR产物片段为485bp和/或214bp和/或191，则为大肠杆菌ETEC; 若PCR产物片段为225bp和/或465bp，则为大肠杆菌EHEC; 若PCR产物片段为299bp，则为大肠杆菌EAEC; 若PCR产物片段为260bp，则为大肠杆菌EIEC或志贺氏菌； 若PCR产物片段为249bp，则为沙门氏菌； 若PCR产物片段为389bp，则为空肠弯曲菌； 若PCR产物片段为424bp，则为结肠弯曲菌； 若PCR产物片段为354bp，则为霍乱弧菌； 若PCR产物片段为413bp，则为副溶血弧菌； 若PCR产物片段为396bp，则为小肠结肠炎耶尔森氏菌。6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR反应，各引物在引物预混液及 PCR反应液中的浓度分别为：7. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，多重PCR反应条件为:95°C预变性15min; 95°C30s，58-62°C90s，72°C60s，5 个循环； 95°C30s，64-68°C90s，72°C60s，5 个循环； 95°C30s，54-56°C90s，72°C60s，30 个循环； 72°C 延伸 3min; 上述热循环的升降温度为2.5°C/s。8. 如权利要求4-7任一所述的试剂盒，其多重PCR结果以具有高分辨率的毛细管电泳设 备进行分析。9. 如权利要求4-7任一所述的试剂盒，还含有内对照质粒pMD18T-IAC 104-105拷贝。10. 权利要求4-9任一所述的试剂盒在检测腹泻病原菌中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种同时检测12种腹泻病原菌的试剂盒及其应用，属于多重PCR检测技术领域。本发明的试剂盒含有分别针对12种常见腹泻病原菌的特异性嵌合引物和一对内参引物，特异性嵌合引物对的核苷酸序列分别如SEQ？ID？NO.1-32所示。本发明试剂盒通过设置多重PCR体系，优化反应条件，经单管一次PCR、琼脂糖电泳分析产物长度实现了对12种腹泻病原菌的准确检测。本发明的试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，适合对临床腹泻样本中常见病原菌的初筛和腹泻病的流行病学调查，具有良好的应用前景。
【IPC分类】C12Q1/04, C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105441539
【申请号】CN201510882630
【发明人】张京云, 管红霞, 凌霞, 阚飙
【申请人】中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 无锡市疾病预防控制中心
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月3日