骤3. (R)K1-U-氰基-I-环戊基乙基)-lH-吡唑-4-基]-2-甲氧基-7H-吡咯并 [2,3-d]嘧啶-5-基乙酸酯
[0248] 将3-环戊基-3-[4-(5-碘-2-甲氧基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-lH-吡唑-1-基]丙腈（0·25g，0·54mm Ol)的乙酸（3mL)溶液用醋酸银（0·27g，l·6mmOl)处理并加热至70 °C，持续16h。将混合物过滤，用MeCN冲洗，将水加入到滤液中并将该混合物搅拌20min。将固 体氯化钠加入到该溶液。通过用三份乙酸乙酯萃取该含水混合物来获得产物。将合并的萃 取物经硫酸钠干燥、倾析和浓缩。产物的一部分未经进一步纯化便用于水解步骤(步骤4)。 1H NMR(300MHz，CDCl3)49.87(br s，lH)，8.39(s，lH)，8.37(s，lH)，7.33(s，lH)，4.22(dt， 1H),4.06(s,3H),3.14(dd,lH),2.94(dd,lH),2.64-2.47(m,lH),2.36(s,3H),2.03-1.86 (m,1H),1.79-1.12(m,7H)；LCMS(M+H) + ：395.1 〇
[0249] 步骤4· (R)-3_环戊基-3-[4_(2-羟基-5-氧代-6，7-二氢-5H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-基)-1Η-吡唑-1-基]丙酰胺
[0251] 将乙酸（2mL，8mmol)中的4M HBr加入到4-[1-(2_氰基-1-环戊基乙基）-1Η-吡唑-4-基]-2-甲氧基-7H-吡咯并[2,3-(1]嘧啶-5-基乙酸酯(0.05(^，0.13111111 〇1)，并将反应物搅 拌lh。在真空下除去挥发物。将残留物复水，且用制备型HPLC-MS(用包含0.15%NH4〇H的 MeCN/H20梯度洗脱）得到纯化产物（12mg，26 % )。1H MMR(500MHz，Cl6-DMSO): δ9 · 20 (s，1H)， 8.69(s,lH),7.34(s,lH),6.75(s,lH),4.49(dt,lH),3.89(s,2H),2.80(dd,lH),2.64(dd, lH),2.36-2.26(m,lH),1.83-1.74(m,lH),1.63-1.36(m,4H),1.32-1.20(m,2H),1.15-1.05 (m，lH) ;LCMS(M+H) + :357.0。
[0252] 步骤5.(R)-3-环戊基-3-[4-(2-羟基-5-氧代-6,7-二氢-5H-吡咯并[2,3-d]嘧啶- 4-基)-1Η-吡唑-1-基]丙腈
[0253] 向3-环戊基-3-[4-(2-羟基-5-氧代-6,7-二氢-5H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基）-lH-吡唑-1-基]丙酰胺（0·006g，0·02mmol)的包含三乙胺（20TL，0·2mmol)的二氯甲烷 (0.5mL)溶液加入三氯乙酰氯（20TL，0.2mmol )。当反应完成时，用制备型HPLC-MS(包含 0 · 15 % NH40H的MeCN/H20)得到纯化产物（3mg，52 % )。1H NMR(400MHz，Cl6-DMSO): δ 11 · 39 (br s，1H)，9.37(s，1H)，8.77(s，lH)，8.63(s，lH)，4.68-4.59(m，lH)，3.94(s，2H)，3·19-3·15 (m,2H),2.42-2.30(m,lH),1.86-1.75(m,lH),1.69-1.20(m,6H),1.18-1.05(m,lH)；LCMS(M +H)+：339.1〇
[0254] 实施例 2:(3R)-3-[(lR，2R)-2-羟基环戊基]-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-lH-吡唑-1-基]丙腈和(3S)-3-[(lR，2R)-2-羟基环戊基]-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧 啶-4-基)-1Η-吡唑-I-基]丙腈以及（3R)-3-[(lS，2S)-2-羟基环戊基]-3-[4-(7H-吡咯并 [2,3-(1]嘧啶-4-基)-1!1-吡唑-1-基]丙腈和(33)-3-[(13,23)-2-羟基环戊基]-3-[4-(7!1-吡咯并[2,3-d]啼啶-4-基)-1Η-吡唑-卜基]丙腈
[0256] 步骤l.(lS，2R)-2_(叔丁基二甲基甲硅氧基)环戊烷甲酸乙酯和（lR，2S)-2_(叔丁 基二甲基甲硅氧基)环戊烷甲酸乙酯
[0258] 向叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物（0.524g，3.48mmolWPlH4f_(0.473g， 6.95mmol)的N，N-二甲基甲酰胺（15mL)溶液加入顺式-2-羟基-1-环戊烷甲酸乙酯（外消旋 的，Acros)(0.50g，0.0032mol)。将反应物搅拌 16h。将另外的咪唑（0.4(^，5.8111111〇1)和叔丁 基二甲基甲硅烷基氯化物(0.50g，3.3mmol)分批添加，并将反应物搅拌另外的24h。产物用 己烷萃取。将萃取物用水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤和蒸发以得到外消旋的TBS保护的羟基 酯（〇.9g)，其未经进一步纯化即使用。 1H MMR(400MHz，CDC13) j4.46(ddd，lH)，4· 19(dq， 1H)，4.01(dq，lH)，2.72(dt，lH)，2.22-2.11(m，lH)，1.96-1.49(m，5H)，1.26(t，3H)，0·84 (s，9H)，0.03(s，3H)，0.01(s，3H)。
[0259] 步骤2. (lS，2R)-2_(叔丁基二甲基甲硅氧基)环戊基甲醛和（lR，2S)-2_(叔丁基二 甲基甲硅氧基)环戊基甲醛
[0261] 在_78°C下，向来自步骤1的（IS，2R)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基)环戊烷甲酸乙酯 和（lR，2S)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基)环戊烷甲酸乙酯(0.86g，3.2mmol)的己烷(40mL)溶 液滴加 1.0 M二异丁基氢化铝的甲苯(3.5mL，3.5mmol)溶液。将反应混合物在-78°C下搅拌Ih 并通过滴加甲醇(2mL)淬灭该温度。停止冷却并使混合物达到环境温度。加入罗谢尔盐水溶 液。将两相混合物用力搅拌2h并分离所得到的层。水层用己烷萃取一次，然后用三部分乙酸 乙酯萃取。将合并的萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，倾析和浓缩以得到外消旋的醛产物 (0.7 8,97%)，其未经进一步纯化即使用。1!1匪1?(4001抱，0)(：13)39.74((1，1!〇,4.62((1(1(1， 1H),2.68-2.61(m,lH),2.22-2.11(m,lH),1.95-1.83(m,lH),1.80-1.57(m,4H),0.85(s, 9H)，0.05(s，3H)，0.04(s，3H)。
[0262] 步骤3.(E)-3-((lR，2R)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基}环戊基）丙烯腈和（Z)-3-((lR，2R)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基}环戊基）丙烯腈以及(E)-3-((lS，2S)-2-(叔丁基二 甲基甲硅氧基}环戊基)丙烯腈和(Z)-3-((lS，2S)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基}环戊基）丙 烯腈
[0264] 向（lS，2R)-2_(叔丁基二甲基甲硅氧基)环戊基甲醛和（lR，2S)-2_(叔丁基二甲基 甲硅氧基)环戊基甲醛(0.36 8，1.6!11111〇1，来自步骤2)的甲苯(91^)溶液加入(三苯基膦）乙腈 (0.475 8，1.58111111〇1)，并将反应物加热至80°(3，持续211。将反应物冷却至室温并加入水。产物 用三份乙醚萃取。将萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，倾析和浓缩以得到E-烯烃同分异构 体和Z -烯烃同分异构体的外消旋混合物，其未经进一步纯化即使用。1 H N M R (4 0 0 M H z， 〇)(：13):36.82((1(1，1!1，反式烯烃），6.63((1(1，1!1，顺式烯烃），5.307((1(1，1!1，反式烯烃），5.305 (dd，lH，顺式烯烃），4.24(ddd，lH)，4.20(ddd，lH)，2.96-2.86(m，lH)，2.53-2.43(m，lH)， 1.95-1.56(111，12!〇,0.87(8,9!〇,0.86(8,9!〇,0.04-0.01(单峰，一共12!〇。
[0265] 步骤 4·(3R)-3-[(lR，2R)-2-羟基环戊基]-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-lH-吡唑-1-基]丙腈和（3S)-3-[(lR，2R)-2-羟基环戊基]-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1Η-吡唑-1-基]丙腈以及(3R)-3-[(lS，2S)-2-羟基环戊基]-3-[4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1Η-吡唑-1-基]丙腈和(3S)-3-[(lS，2S)-2-羟基环戊基]-3-[4-(7H-吡咯并 [2,3-(1]嘧啶-4-基)-1!1-吡唑-1-基]丙腈
[0266] 向化)-3_((11?，21〇-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基）环戊基）丙烯腈和（2)-3-((11?， 2R)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基)环戊基)丙烯腈以及(E)-3-((lS，2S)-2-(叔丁基二甲基甲 硅氧基）环戊基）丙烯腈和（2)-3-((15,25)-2-(叔丁基二甲基甲硅氧基）环戊基）丙烯腈 (0.40g，1.6mmo 1，来自步骤3的粗产物）的乙腈(20mL)溶液加入4-(1H-吡唑-4-基)-7- {[ 2-(三甲基甲硅烷基）乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-(1]嘧啶(0.5(^，1.6111111〇1)和1，8-二氮杂 二环[5.4.0 ] ^碳-7-烯(DBU，0.24mL，1.6mmo 1)。将反应物在室温搅拌2h，并加入另外的 DBU (0.24mL，1.6mmo 1)。将反应物搅拌3天并浓缩。快速柱色谱法（用10-40 %乙酸乙酯/己烷 的梯度洗脱）用于纯化产物，产物然后用DCM中的20%TFA处理3h，蒸发并用过量的乙二胺的 甲醇溶液处理过夜。当SEM保护基的除去完成时，通过用EtOHAfeO/浓HCl (10:4:3体积比）搅 拌3小时来除去任何剩下的TBS保护基。完全脱保护的产物通过制备型HPLC-MS(MeCN/H 20梯 度中的0.15 %NH40H)来纯化。汇集M+H = 323的所有级分中并蒸发(约80mg)。使产物经历如 下一系列手性色谱纯化：用20%Et0H/80%己烷以25mL/min的流速洗脱的Chiral Technologies Chiralcel 0J_H(3 X 25cm, 5Tm)以得到峰I (19mg)，不被收集的以下次峰:峰 2(60mg)、峰3(6mg)。峰2是混合物，其然后使用70%Et0H/30%己烷的梯度以8mL/min的流速 洗脱的Chiral Technologies Chiralpak IA(2X25cm，5Tm)进一步分离为三种组分。这些 是标记的峰2-1 (试验2，峰I，32mg)，其是产物混合物;峰2-2(6.5mg)和峰2-3( 13.7mg)。峰2-1使用25 %Et0H/75 %己烷的梯度以12mL/min的流速洗脱的Chiral Technologies Chiralpak IA(2 X 25cm, 5Tm)进一步分离为三种组分。分离的产物是标记的峰2_1_1 (10.5mg);2-1-2(13mg)jP2-1-3(2.3mg)。
[0267] NMR(500MHz，CD30D):S8.65(s，lH)，8.62(s，lH)，8.37(s，lH)，7.49(d，lH)， 6.95(d,lH),4.71(ddd,lH),4.28(br t,1H),3.26(dd,1H),3.21(dd,1H),2.53-2.45(m, 1H)，I·98-1·73(m，3H)，I·62-1·47(m，2H)，I·38-1·29(m，1H);LCMS(M+H) +: 323。
[0268] 峰2-1-1 = 1H NMR(300MHz ,CD3OD) :S8.64(s，lH)，8.59(s，lH)，8.38(s，lH)，7.49(d， 1H),6.94(d,lH),4.90-4.78(m,lH),3.64(br t,1H),3.21(dd,1H),3.07(dd,1H),2.55-2.40(m,1H),2.01-1.58(m，6H);LCMS(M+H) +:323。
[0269] 峰2-1-2 = 1H NMR(500MHz ,CD3OD):δ8·65(s，1H)，8·62(s，1H)，8 ·37(s，1H)，7.49(d， 1H),6.95(d,lH),4.71(ddd,1H),4.28(br t,1H),3.26(dd,1H),3.21(dd,1H),2.53-2.45 (m，lH)，1.98-1.73(m，3H)，1.62-1.48(m，2H)，1.38-1.26(m，lH) ;LCMS(M+H)+:323。
[0270] 峰2-3 = 1H NMR(300MHz,CD3OD): δ8· 64(s，1H)，8.59(s，lH)，8.38(s，lH)，7.48(d， 1H),6.93(d,lH),4.90-4.78(m,lH),3.64(br t,1H),3.21(dd,1H),3.07(dd,1H),2.55-2.40(m,1H),2.01-1.58(m，6H);LCMS(M+H) +:323。
[0271] 实施例3:外消旋的3-(l_羟基环戊基)-3-[4_(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-lH-吡唑-1-基]丙腈三氟乙酸盐
[0273] 步骤1.卜[(三甲基甲硅烷基)氧基]环戊基甲醛
[0275] 反应以与Tetrahedron,50(9) ,2821-30; 1994中所描述的工序相似的工序进行： 在-4 5°〇下，向1-[(三甲基甲硅烷基）氧基]环戊腈（2.258，12.3111111〇1，如在 Organometal I i cs ,3(11) ,1660-5 ;1984所描述的制备）的甲苯（18mL)溶液滴加己烧 (17.2mL，17.2mmol)中的1.0 M二异丁基氢化铝。然后使溶液升温至0°C并在该温度搅拌lh。 将反应混合物倒入乙醚(25mL)和氯化铵(25mL，饱和的）的混合物中。在15°C下，向所得到的 混合物加入稀硫酸溶液(通过用50mL水稀释1.53mL浓H 2SCk来制备）。然后将溶液在5°C的温 度下搅拌过夜。混合物用三份乙醚来萃取，将合并的萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，倾 析和浓缩以得到产物（0.84 8,36%)，其未经进一步纯化即用于步骤2。1!1匪1?(3001〇^， CDCl3):S9.47(s，1H)，1.88-1.46(m，8H)，0.00(s，9H)。
[0276] 步骤2.(2E)-3-U-[(三甲基甲娃烷基)氧基]环戊基}丙鋼青和（2Z)-3-U_[(三甲 基甲娃烷基)氧基]环戊基}丙稀臆
[0278] 在0°C下将氰基甲基膦酸二乙酯（0.91211^，5.64111111〇1)滴加到氢化钠（0.198 8， 4.96mmol)的四氢咲喃（IOmL)悬浮液中。加入之后，将反应物升温至室温并搅拌45分钟。将 混合物再冷却至〇°C并引入四氢呋喃（20mL)中的1-[(三甲基甲硅烷基）氧基]环戊基甲醛 (0.84g,4.5mmol)。使反应物升温至室温并搅拌2小时。将水和乙酸乙酯加入反应物中，并分 离层。水层用两份乙酸乙酯萃取。将组合的有机萃取物用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，倾析和 浓缩以得到呈烯烃同分异构体混合物的产物，该产物未经进一步纯化即用于步骤3</H NMR (30010^，0>(：13)36.80((1，1!1，反式/主要产物），6.53((1，1!1，顺式/次要产物），5.52((1，1!1， 反式），5.28(d，IH，顺式），2.06-0.76(m，对于两种同分异构体总共16H)，0.18(s，9H，次要产 物），0.13( 8,9!1，主要产物）。
[0279] 步骤3.外消旋的3-(1_羟基环戊基)-3-(4-(7-((2_(三甲基甲硅烷基）乙氧基）甲 基)-7H-吡咯并[2,3-(1]嘧啶-4-基)-1!1-吡唑-1-基)丙腈
[0281] 向（2Ε)-3-{1-[(三甲基甲硅烷基)氧基]环戊基}丙烯腈和(2Ζ)-3-{1-[(三甲基甲 硅烷基)氧基]环戊基}丙烯腈(0.94 8,4.5111111〇1)以及4-(1!1-吡唑-4-基)-7-{[2-(三甲基甲 硅烷基）乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-(1]嘧啶（1.48,4.5111111 〇1)的乙腈(2〇1^)悬浮液加入 1，8-二氮杂二环[5.4.0 ] -|碳-7-稀(0.67mL，4.5mmo 1)。将反应物在室温下搅拌6天。蒸发 乙腈。使用己烷中的0-80%乙酸乙酯的梯度洗脱的快速柱色谱法从未受保护的醇和TMS保 护的醇产物的混合物分离所需的不受保护的醇产物(890mg，44% )。咕NMR(300MHz，⑶Cl3): 58.87(s,1H),8.56(br s,1H),8.35(s,1H),7.46(d,1H),6.84(d,1H),5.69(s,2H),4.40 (dd,lH),4.03(s,lH),3.55(dd,2H),3.46(dd,lH),2.97(dd,lH),2.04-1.27(m,8H),0.93 (dd，2H)，-0.05(s，9H) ;LCMS(M+H)+:453.1。
[0282] 步骤4.外消旋的3-(1-羟基环戊基)-3-[4_(7Η-吡咯并[2,3_d]嘧啶-4-基)-1Η-吡 唑-1-基]丙腈三氟乙酸盐
[0283] 将外消旋的3-(1_羟基环戊基)-3-[4-(7-{[2_(三甲基甲硅烷基）乙氧基]甲基}_ 7Η-吡咯并[2,3-(1]嘧啶-4-基)-1!1-吡唑-1-基]丙腈(0.10(^，0.221臟〇1)的二氯甲烷(41^) 和三氟乙酸（ImL)溶液搅拌2小时并蒸发溶剂。将残留物用甲醇(4.5mL)中的乙二胺(O.lmL， 2mmol)搅拌1小时并蒸发。将粗产物在甲醇中复水，并使用制备型HPLC-MS，通过两个连续的 色谱步骤(对于第一操作，用包含0.15 ^NH4OH的乙腈/H2O梯度洗脱，随后对于第二操作，用 包含0.1 % T F A的乙腈/ H 2 0梯度洗脱）来纯化，得到呈三氟乙酸盐的外消旋产物。1 H N M R (400MHz,de-dmso)：512.72(br s,1H),8.94(s,1H),8.86(s,1H),8.49(s,1H),7.82(s,1H), 7.21(s,lH),4.80(dd,1H),3.51(dd,lH),3.22(dd,lH),1.79-1.42(m,7H),1.25-1.15(m, lH)；LCMS(M+H)+：323.1〇
[0284] 实施例A
[0285]在药代动力学和毒物动力学研究方面，在施用化合物I之后，从人、大鼠或狗的尿、 血浆或粪便分离代谢物1-39。代谢物的种类在分离代谢物之后使用HPLC方法来确定。表2中 展示了所用方法和相应的代谢物保留时间。根据阐明结构信息的需要，进行串联MS/MS分析 和高阶MS n实验。
[0286] 化合物I证实在m/z 307处的质子化分子离子，且产物离子光谱在m/z266、186和 159处显示出信号。m/z 266处的碎片离子与腈部分的丢失一致。m/z 186处的特征碎片离子 指示完整环戊基丙腈部分的丢失。m/z 159处的碎片离子指示环戊基丙腈的丢失以及通过 化合物I的吡唑环的开裂。
[0287] 主要在来自人受试者的尿中观察到代谢物化合物1、2、27和29,且在血浆中观察到 痕量水平的化合物27和29。全扫描质谱法证实m/z 339处的质子化分子离子，与化合物I的 双羟基化一致。对于这些代谢物，这些m/z 339离子的产物离子碎裂产生实际上相同的光 谱，具有在m/z 321、186、159和154处观察到的离子。m/z 321处的离子与失水一致且表明至 少一种羟基化可以在环戊基环上。m/z 186和m/z 159处的离子与完整的吡唑-吡咯并嘧啶 一致。m/z 154处的离子与整个未修饰的吡唑/吡略并啼啶部分的中性丢失一致。m/z298和 m/z 280处的较少的碎片离子表明乙腈成分的丢失，具有和没有容易的失水，还限制对环戊 基部分的羟基化位置。这进一步由m/z 237处的离子支持，m/z 237处的离子与经修饰的环 戊基的丢失一致，留下未经修饰的分子剩余部分。
[0288]化合物31