存在于人受试者的尿中。全扫描质谱法证实m/z 339处的质子化分子离 子与向化合物I加入32原子质量单位一致。m/z 339离子的产物离子碎裂产生m/z 311、218 和191处的碎片离子。m/z 218处的原碎片(primary fragment)与向吡唑-吡略并啼啶部分 加入32原子质量单位一致。m/z 191处的碎片离子与CHN从假定的双羟基化的吡唑-吡咯并 嘧啶的吡唑部分丢失一致，限制了对吡咯并嘧啶进行修饰的位置。m/z 311处的碎片离子可 能起因于酰胺键的初始开裂，随后是吡咯烷酮的CO丢失。使用单独的质谱法对化合物31进 行结构指定导致不确定的结果，因此将化合物31从人尿分离出并通过 1H和13C NMR分析。31 的结构被鉴定为化合物I的饱和的吡咯并嘧啶部分的酰胺-醇代谢物。31的质子NMR光谱在δ 3.56处具有强度为2Η的单峰。该单峰与δ177.9处的碳具有长程相关性，与酰胺一致。此外， Η3和Η9之间出现核奥弗豪泽效应(nOe)。
[0289]化合物32存在于人受试者的血浆和尿中。全扫描质谱法证实m/z 339处的质子化 分子离子与向化合物I加入32原子质量单位一致。m/z 339离子的产物离子碎裂产生m/z 218和191处的碎片离子。m/z 218处的裂变碎片与向吡唑-吡咯并嘧啶部分加入32原子质量 单位一致。m/z 191处的碎片离子与CHN从假定的双羟基化的吡唑-吡咯并嘧啶的吡唑部分 丢失一致，限制了对吡咯并嘧啶进行改性的位置。使用单独的质谱法对化合物32进行结构 指定导致模棱两可的结果，因此将化合物32从人尿分离出并通过 1H和13C NMR分析。32的结 构被鉴定为化合物I的饱和的吡咯并嘧啶部分的酮醇代谢物。32的质子NMR光谱具有在δ 3.82处的单峰，该单峰具有2Η的强度并示出与δ191.5处的碳的长程相关性，与酮一致。从Η2 至任何其它质子没有观察到核奥弗豪泽效应(nOe)。
[0290]在来自人受试者的血浆和尿中观察到化合物40。全扫描质谱法证实m/z341处的质 子化分子离子与向化合物I加入34原子质量单位一致。m/z 341离子的产物离子碎裂产生m/ z 323、220、202和175处的碎片离子。m/z 323处的碎片离子起因于吡咯烷二醇的失水。m/z 220和202处的碎片离子与双羟基化的饱和的吡咯并嘧啶一致，具有和没有观察到的容易的 失水。m/z 175处观察到的离子与在容易的失水之后双羟基化饱和吡唑吡咯并嘧啶的吡唑 部分的CHN丢失一致。化合物40被鉴定为3-环戊基-3-(4-(5,6-二羟基-6,7-二氢-5H-吡咯 并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1Η-吡唑-1-基)丙腈。
[0291]在来自人的尿中观察到具有499的观察的m/z的化合物I的单羟基化代谢物的共辄 物，且还在人血浆中以痕量观察到七种共辄物中的两种。对于这些代谢物中的六种，初始的 产物离子碎裂产生实际上相同的光谱，且m/z 323处的观察离子与葡糖苷酸共辄物的丢失 一致。这些m/z 323碎片离子的产物离子碎裂(MS3)再次证实实际上相同的质谱，具有在m/z 305、186和159处的碎片离子。m/z 305处发现的碎片离子与失水（18原子质量单位)一致，表 明在分子的饱和部分上的羟基化和随后碰撞引起的碎裂，限制了对环戊基部分进行修饰的 部位。m/z 186和m/z 159处的碎片离子与未修饰的吡唑-吡咯并嘧啶一致。另外的较小的碎 片离子太弱以致不能以任何确定性来指定它们。这些假定的代谢物的同一性通过用葡糖 苷酸酶水解分离的葡糖苷酸共辄物以展示糖苷配基来证实，糖苷配基然后进行HPLC-MS的 分析，其中所释放的糖苷配基的保留时间和质谱与单羟基化代谢物标准品的保留时间和质 谱匹配。这些葡糖苷酸共辄物代谢物的糖苷配基对应于2-羟基代谢物(代谢物9,表1)和3-羟基代谢物(代谢物8,表1)。第七葡糖苷酸共辄物代谢物即化合物42的糖苷配基对应于化 合物I的吡唑-吡咯并嘧啶部分的单羟基化代谢物，其并未在来自人受试者的血浆或尿中独 立地观察到。全扫描质谱法证实m/z 323处的质子化分子离子与向化合物I加入162原子质 量单位一致。m/z 323离子的产物离子碎裂产生m/z 202处的裂变碎片，其与向吡唑-吡咯并 嘧啶部分加入16原子质量单位一致。m/z 175处的碎片离子与CHN从假定的羟基化的吡唑-吡咯并嘧啶的吡唑部分丢失一致，限制对吡咯并嘧啶进行修饰的位置。代谢物化合物42的 结构被鉴定为化合物I的单羟基化吡咯并嘧啶部分的葡糖苷酸共辄物。
[0292]代谢物化合物41存在于来自人受试者的尿。全扫描质谱法表明m/z 583处的质子 化分子离子与未修饰的化合物I的葡糖苷酸共辄一致。m/z 583离子的产物离子碎裂产生m/ z 307处的裂变碎片，其与完整的葡糖苷酸的丢失一致。m/z 186和m/z 159处的较小的碎片 离子与对于化合物I观察到的那些一致。m/z 307碎片离子的MS3碎裂还展示m/z 186和m/z 159处的碎片离子。化合物41被鉴定为化合物I的N-连接的葡糖苷酸共辄物。
[0293]表 2
[0298] 方法Al :14C_化合物I在人、狗和小鼠的血浆、尿和粪便样品中的生物转化
[0299] 代谢物谱的样品制备：
[0300] 血浆：
[0301] 根据主题和/或根据时间点收集来自所有受试者的血浆样品。将所收集的血浆样 品如下制备用于HPLC-放射性测量分析:将所收集的血浆样品的等分试样最初用约两等(W/ V)体积的在HPLC级乙腈中的1%甲酸萃取，随后用力涡旋并离心以除去变性的血浆蛋白。将 上清液保留并通过预处理的Waters C-18固相萃取柱体，且保留滤液。保留SPE柱体。剩下的 血浆小球然后用HPLC级乙腈/水(90/10)中的1 %甲酸萃取三次，且在每一次萃取之后离心。 保留所有的上清液。每份甲酸/乙腈/水萃取上清液用于洗脱SPE柱体。SPE柱体然后用甲醇 中的1%甲酸冲洗。将所有的洗提液保留，合并，并在30°C于氮气流下蒸发。将该萃取的剩余 部分在约0.6ml的在水中的0.1 %甲酸中复水，涡旋并离心以除去颗粒物质。然后通过HPLC-流动放射测定和HPLC-MS来分析上清液。
[0302] 尿：
[0303] 从各受试者收集约等量的尿等分试样以表示适当时间间隔后的剂量。在HPLC-放 射性测量分析之前，将所收集的各尿样以4,000rpm离心10min以除去颗粒物质，然后直接分 析。
[0304] 粪便：
[0305] 从各受试者收集粪便匀浆的等分试样以表示适当时间间隔后的剂量。将所收集的 粪便匀浆样品如下制备用于HPLC-放射性测量分析：
[0306]将约5克粪便匀浆的等分试样最初用约两等(W/V)体积的Millipore水萃取，随后 离心除去固体。将上清液保留并通过预处理的Waters C-18固相萃取柱体。保留SPE柱体。然 后将剩下的粪粒用HPLC级乙腈/水(90/10)中的1%甲酸萃取三次，且在每一次萃取之后离 心。保留所有的上清液。每一个甲酸/乙腈/水萃取上清液用于洗脱SPE柱体。将所有的洗提 液保留，组合，并在30°C氮气流下蒸发。将该萃取的剩余部分在约2.Oml的在水中的0.1%甲 酸中复水，涡旋并离心以除去颗粒物质。然后通过HPLC-流动放射测定和HPLC-MS来分析上 清液。
[0307] HPLC-流动放射测定分析方法：
[0308]所有的样品通过HPLC-流动放射测定或HPLC-MS，使用实际相同的分析系统来分 析。HPLC-流动放射测定系统由Agilent HPllOO系列四元栗(Quaternary pump)、自动取样 器和与具有500yL·液体闪烁室的Raytest Ramona-90流动闪烁探测器连接的UV探测器组成。 化合物I和其代谢物的分离使用Waters Symmetry C-18HPLC柱，4 · 6 X 250mm, 5μηι粒度HPLC 柱来实现。流动相"Α"由HPLC级水中的0.1 %甲酸组成，且流动相"Β"由HPLC级甲醇/乙腈（I: 1)组成。分析物的洗脱通过使用流动相"B"的线性增加梯度来实现。根据需要，两种不同的 梯度洗脱方法在不同时间采用。在下面在表3和表4中概述这两种方法的色谱条件。
[0309] HPLC-质谱法分析方法：
[0310] HPLC-流动放射测定系统由Agilent HPllOO系列四元栗和与以正离子探测模式操 作的Applied BiosystemsAPI 4000Qtrap连接的Leap Technologies CTC-PAL自动取样器 组成。全扫描(MS)和数据依赖性产物离子扫描(MS2)用于表征化合物I的代谢物。选择MRM转 换还用于扫描和确定先前确定的和表征的代谢物。化合物I和其代谢物的分离使用Waters Symmetry C-18HPLC柱，4 · 6 X 250mm, 5μπι粒度HPLC柱来实现。流动相"A"由HPLC级水中的 0.1 %甲酸组成，且流动相"B"由HPLC级甲醇/乙腈（1:1)组成。分析物的洗脱通过使用流动 相"B"的线性增加梯度来实现。根据需要，两种不同的梯度洗脱方法在不同时间采用。在下 面在表3和表4中概述这两种方法的色谱条件。
[0311]表3
[0316] 方法A2:化合物I的生物转化:代谢物的分离
[0317] 从人尿分离代谢物：
[0318] 使用20cc Waters HLB SPE柱体（1克吸附剂）的固相萃取用于浓缩来自所收集的 尿样的化合物I的代谢物。将柱体首先用100 %HPLC级甲醇进行处理，然后用Mi 11 ipore水处 理。然后将柱体立即装载上高达IOml的原状未处理的尿。随后使用水中的若干浓度的HPLC 级甲醇来洗脱柱体(表5)。
[0319] 表5
[0321] 对于存在化合物I和目标代谢物，通过LC-MS来分析初始尿的等分试样、最后的装 载体积和每次洗涤/洗脱体积。不存在体积为Millipore水中的高达25%甲醇的装载体积或 在洗涤体积/洗脱体积中任一种的显著量的化合物I或其代谢物。在100%甲醇洗脱等分试 样中未发现显著量的药物或代谢物。从50%和75%甲醇洗脱的洗脱体积各自使用Genevac 离心蒸发器来减少体积并在连续注射到LC-MS上之前复水至~2mL的最终体积，用于目标代 谢物的级分收集。
[0322] 分析条件：
[0323] 通过LC-MS使用与由Sil-HTC自动取样器和系统控制器以及两个SillOADVp高压LC 栗组成的Shimadzu二元HPLC堆连接的Finnigan LCQ Deca XP Plus来分析样品。质谱以正 离子探测模式操作，使用数据依赖性扫描以产生MS和数据依赖性MS2数据。Shimadzu UV探 测器Sil SroiOAVp以254nm的探测波长用于监测与质谱仪一致的HPLC洗提液。
[0324] 流动相"A"由用甲酸（约0.1体积％ )将pH调节至pH 3.2的5mM甲酸铵组成。流动相 "B" 由90% 乙腈/10% 甲醇组成。所使用的HPLC柱是Zobax XDB C-18，3 · OmmX 150mm, 5 · Ομπι 粒度。分析物的洗脱是通过使用流动相"Β"的线性增加梯度。在下面在表6概述分析规模分 析的色谱条件。
[0325] 表 6
[0327] 半制备型分析条件：
[0328] 如上通过LC-MS分析样品，具有以下变化：
[0329] 所使用的HPLC柱是Phenomenex Polar RP 1 OmmX 1 50mm 5μηι粒度。
[0330] 初始的分级使用中性乙酸铵作为"Α"相来进行，且单个收集峰的第二提纯步骤使 用水中的0.025%甲酸作为"A"相来进行。流动相"B"由90%乙腈/10%甲醇组成。
[0331 ]分析物的初始洗脱和自动级分收集是通过使用流动相"B"的线性增加梯度。在下 面在表7概述初始的半制备型分析的色谱条件，但在第二提纯步骤，根据每一种单独代谢物 的需要来优化％B。
[0332]表 7
[0334] *在第二分级步骤，对每一种单独代谢物进行优化
[0335] 半制备型分析的洗脱剂流使用PEEK三通和管道来分流，且~1.65ml/min的洗脱剂 流用于级分收集，且剩余部分转到质谱仪。洗脱剂流组成通过MS和选择的MS-MS实验来监 测。包含目标分析物的部分通过利用与部分收集器一致的转换阀来自动收集。
[0336] 方法A3:化合物I在人和大鼠血浆和尿样中的生物转化
[0337] 样品制备：
[0338] 在单一剂量和/或多剂量研究之后，从已经口服化合物I的动物和人受试者获得血 浆和尿样。通过时间加权平均收集来收集每一个受试者的剩余血浆样品。将所收集的血浆 样品的等分试样（15〇 yL)用两体积的乙腈来沉淀，涡旋混合并然后离心。将上清液除去并用 于LC-MS分析。对于人，从研究中的每一个个体收集尿样以表示临床研究的第1天(单一剂量 研究)和第10天(多剂量研究）的0-12小时。在分析之前将尿样以~15000 Xg离心10分钟并 直接注入。
[0339]样品分析：
[0340] 使用电喷雾离子化LC-MS，通过以正电离模式操作的Thermo Finnigan LCQ Deca- XP Plus Ion-Trap质谱仪（Thermo-Fisher Scientific Waltham MA,USA)来测定样品。数 据依赖性扫描用于产生初始的MS至MS2数据。根据阐明结构信息的需要，进行高阶MSn实验。 质谱仪连接至与Shimadzu LC-10A二元梯度栗系统（Shimadzu Scientific Instruments, Columbia,MD,USA)组合的Shimadzu Sil HT-C组合的自动取样器/控制器。梯度条件在表8 中描述。化合物1和其代谢物的分离使用2〇4&1父08(：-18^^(：柱（3.0\150111111，3.54111) (Agilent，Santa Clara，CA USA)以300yL/min的流动相流速来实现。流动相"A"由已经用甲 酸将pH调节至pH 3.2的在Mi 11 ipore水中的5mM甲酸铵组成。流动相"B"由90 %乙腈/10 %甲 醇组成。
[0341 ] 表8 · HPLC梯度洗脱方案
[0344] 方法A4:大鼠胆汁、血浆和尿的代谢物表征方法
[0345] 从施用化合物I的大鼠收集尿、粪便和胆汁样品。每个时间点收集每一个样品的约 30%，使得来自一个大鼠的排泄剂量的90 %被包含在单个样品中。单独地分析来自每一个 大鼠的样品。粪便样品使用乙腈来萃取，且萃取回收率通过萃取物的液体闪烁计数(LSC)和 未被萃取的粒料的燃烧和LSC来确定。当可用时，使用代谢物标准品确认结构。除非另外指 出，否则不报道代表〈5%施用剂量的峰。
[0346]通过HPLC和质谱法来分析尿、粪便、胆汁和/或血浆样品以确定任何放射性标记的 代谢物的分子量并获得这些代谢物的结构信息。
[0347] 方法A5:分离方法
[0348] 同时从相同物种，即狗或大鼠的单个动物收集来自化合物I药代动力学和毒物动 力学研究的尿样。尿样用乙酸乙酯以1比1的体积比萃取三次。收集乙酸乙酯萃取部分并使 用旋转蒸发器除去挥发物。将所得到的残留物溶解在乙腈:水(l:lv/V)中，并对溶液进行制 备型HPLC纯化。每一种代谢物的分离通过以相继次序使用以下三种HPLC条件来实现。
[0349] 通过使用由水中的0.1 % TFA (溶剂A)和乙腈中的0.1 % TFA(溶剂B)组成的流动相， 在Zobax SB C18柱（19X150mm，5ym)上，使用5%至60%溶剂B的梯度和15mL/min的流速经 20分钟对浓缩的萃取物进行纯化。
[0350] 1.然后通过使用由水中的0.1 % TFA(溶剂A)和甲醇（溶剂B)组成的流动相、在柱 Zobax SB C18柱(9.6 X 150mm，5μπι)上，使用5%至95%溶剂B的梯度和4mL/min的流速经25 分钟进一步纯化从第一 HPLC纯化收集的级分。
[0351] 2.对从第二次纯化收集的具有[M+H] + = 321和323的每一个级分进行采用由15% 乙醇和85 %己烷或30 %乙醇和70 %己烷组成的流动相，在采用15mL/min的流速的手性柱 (ChiralCel 0D-H，20X250mm,5μπι)上的手性分离。
[0352] 方法Α6:分析方法
[0353] 35、37和38的保留时间从使用以40°C柱温的Zorbax SB C18柱(4.6X150mm，8〇A， 3.5μπι)、使用由水中的0.05%TFA(溶剂A)和乙腈中的0.05%TFA(溶剂B)组成的流动相、采 用lmL/min的流速、使用表9中示出的梯度洗脱方案的HPLC分析获得。在220nm进行在线UV探 测。
[0354]表9.梯度洗脱方案
[0356] 方法A7:替代分析方法
[0357] 40、41和42的保留时间从使用恥七6^八1^扣18@1'-3冊1^：柱（4.6\15〇111111，3.54111) (Waters Corporation，Milford，MA,USA)、采用400yL/min的流动相流速的HPLC分析获得。 流动相"A"由已经用甲酸将p H调节至p H 3.2的在M i 11 i p 〇 r e水中的5 mM甲酸铵组成。流动相 "B"由100 %甲醇组成。初始的流动相条件是90%流动相"A"/10 %流动相"B"，且在一分钟内 梯级梯度至27%流动相"B"。初始的梯度然后在57分钟内以线性方式进展至52%流动相 "B"，随后在10分钟内第二线性梯度至95 %流动相"B"。接着发生以95 %流动相"B"的五分钟 柱冲洗时间并随后返回至起始条件和在下一个分析注射之前的8分钟柱再平衡。100%的柱 洗脱剂被引导通过监测X254nm的Shimadzu固定波长UV探测器SPD-IOAvp (Shimadzu Scientific Instruments ,Co lumbia ,MD ,USA)。在离开 UV探测器之后，洗脱剂流使用PEEK 三 通来分流以允许约100μΙ的洗脱剂经由电喷雾电离化被引入质谱仪。电喷雾源电压被设置 在4.5kV，具有325°C的毛细管温度，外壳和吹扫气分别被设置在50和30(任意单位）。初始的 数据依赖性MS/MS设置包括2.0原子质量单位的分离宽度和42的碰撞能量设置。所有的其它 仪器设置和电位被优化以实现化合物I的最大信噪比。
[0358] 方法A8:化合物I的葡糖苷酸代谢物的酶促水解。
[0359]化合物I的分离的葡糖苷酸共辄物代谢物用β_葡糖苷酸酶温育，且在所有情况下 反应进行至完成，产生相关的糖苷配基，其使用上述相同的LC-MS方法来分析。将释放的糖 苷配基的保留时间和质谱与化合物I的单羟基化代谢物标准品的保留时间和质谱进行比较 以确定共辄物的同一性。
[0360] 实施例B:
[0361] 假定具有323的分子量的代谢物样品包含羟基的代谢物并被溶解在200yL的从 Isotec获得的CD3OD中。假定具有分子量321的样品由包含酮部分并被溶解在200yL的从 Isotec获得的CDCl3中。将具有不同于上述分子量的分子量的样品溶解在200yL的也从 Isotec获得的DMS〇-d6中。在溶解之后，将每一个样品放入从Wilmad Glass获得的3mm NMR 管。在分析之前立即制备样品。
[0362] 样品使用对于1H在500MHz操作和对于13C在125MHz操作的Varian INOVA匪R分光 计来分析。使用3mm三重共振逆探测梯度探针。在进行所有的数据采集时间期间将样品保持 在30°C。对于每一个样品，将探针锁定并调整。进行其它NMR实验以获得确定结构所需要的 数据。
[0363] 化合物31^(50010^ ,DMSO-D6) 38.58(s，1H)，8.23(s，lH)，4.47(td，lH)，3.56(s， 2H)，3.18(dd，lH)，3.13(dd，lH)，2.35(m，lH)，1.79(m，2H)，1.59-1.39(m，4H)，1.29(m，2H)。
[0364] 化合物32^(50010^ ,DMSO-D6) j9.24(s,