甲酰胺中，加入哌啶(27yL，2equi V)后于室温下搅拌两小时。浓缩反应液，加入乙醚(40mL X 2)超声后过滤，得到固体产物143mg，产率为78%。
[0046]实施例3
[0047]嵌段共聚物mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn 的制备，η为 18
[0048]mPEG-C00H(347mg,0.17mmol，平均分子量为2000)加入到1mL甲苯中，搅拌回流Ih除水后蒸去甲苯并将mPEG溶解于1mL重蒸的二甲基甲酰胺中，氮气保护下加入EDCI(33mg，
0.17mmol)、H0Bt(23mg，0.17mmol)和三乙胺(24yL，0.17mmol)，搅拌I小时后加入Val-Cit-PABC-NH-C18并于室温下继续反应24小时。之后将溶剂除去，再加入1mL 二氯甲烷。将该混合溶液用6mL X 3的水洗，再用6mL的饱和食盐水洗之后用无水硫酸钠干燥，过滤之后将滤液旋干。剩余混合物通过柱层析(CH2Cl2: CH3OH = 40: 1^30: 1^20:1)纯化得到产物160mg，产率为 45 %。
[0049]实施例4
[0050]对照化合物mPEG-Val-Cit-NH-Cn 的制备，η为 18，第一步为 Fmoc-Val-Cit-NH-Ci8 的制备。
[0051]将Fmoc-Val-Cit(2.976g，6mmol)、EDCI(1.26g，I.lequiv)、H0Bt(891mg，
1.lequiv)和三乙胺(917yL，1.lequiv)溶于25mL二甲基甲酰胺中，室温下搅拌I小时后，加入硬脂胺(1.778g，1.lequiv)继续搅拌24小时。用油栗减压蒸馏除去溶剂，残留物中加入10%CH30H/CH2C12(20mLX 2)，超声，过滤，收集固体干燥后得产物2.976g，产率为63.8%。
[0052]实施例5
[0053]对照化合物mPEG-Val-Cit-NH-Cn的制备，η为18，第二步为Val-Cit-NH-Ci8的制备。
[0054]将卩!110(3~\^1-(^1:-冊-(]18(60011^，0.811111101)溶于101111^二甲基甲酰胺中，加入呢啶(159yL，2equiV)后于室温下搅拌2小时，将溶剂旋干，用乙醚(20mL X 2)打浆，过滤，干燥后得固体产物421mg，产率为80%。
[0055]实施例6
[0056]对照化合物mPEG-Val-Cit-NH-Cn 的制备，η为 18，第三步为 mPEG-Val-Cit-NH-Cis 的制备。
[0057]mPEG-C00H(0.8g，0.4mmol)加入到1mL甲苯中回流I小时除水，然后减压蒸馏除去甲苯。之后将mPEG-COOH溶于1mL二甲基甲酰胺中，加入EDCI (77mg，0.4mmol)、H0Bt (54mg，0.4mmol)和三乙胺(56yL , 0.4mmol)。室温下搅拌I小时后加入Val_Cit_Ci8( 168mg，
0.32mmol)，继续搅拌24小时。之后，减压蒸馏除去溶剂，将残留物溶于1mL二氯甲烷中，水洗三次，再用饱和食盐水洗，收集有机层用无水硫酸钠干燥，过滤收集滤液，减压蒸馏除去溶剂，将剩余物通过柱层析(CH2Cl2: CH3OH = 40: 1^30: 1^20:1)分离得到固体产物250mg，产率31 %。
[0058] 实施例7
[0059 ] mPEG-Va 1-Ci t-PABC-NH-Cis胶束的组装
[0060]将2mg mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18溶于0.5mL四氢呋喃中，滴加入搅拌速度为500r/min的1mL超纯水中，滴加完成后继续搅拌4h，用旋转蒸发仪减压蒸馏除去其中的四氢呋喃后，用0.45μπι的针式过滤器过滤，得到mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18胶束的水溶液。动态光散射(如图2(A)DLS图所示)测得粒径为133nm，透射电镜(如图2(B)TEM图所示)观察其形貌为球形。芘荧光探针法测得其临界胶束浓度(CMC)为4.5 X 10—3mg/mL。
[0061 ] 实施例8
[0062]载SN-38 的 mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cis 胶束的制备
[0063]取1mgmPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cis和Img SN-38溶于ImL DMSO中，超声溶解使混合均匀，冻干除去溶剂DMS0。将冻干后的粉末加入1mL去离子水中，超声20min，用0.8μπι的针式过滤器过滤，冷冻干燥，制得载药胶束。
[0064]用高效液相色谱测定其载药量(DL%)和包封率(ΕΕ%)，与SN-38的标准曲线作对照，计算得载药量和包封率分别为6.2 %和62 %。
[0065]载药量(DL% )=(胶束中SN-38的质量/聚合物的质量)X 100%
[0066]包封率(ΕΕ%) = (胶束中SN-38的质量/SN-38投料的质量)Χ100%
[0067]实施例9
[0068]通过动态光散射监测mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18在模拟的肿瘤细胞溶酶体环境中的粒径变化
[0069]预先将50μΙΧΒ的NaAc缓冲溶液(50UI/mL)用10yL的30mMDTT/15mM EDTA溶液对CB进行活化，之后将上述混合溶液加入到ImL0.2mg/mL的胶束溶液中，置于37°C的摇床中，每隔一段时间用DLS测定其粒径。如图3所示，结果表明，在第9天时，mPEG-Val-Cit-PABC-C18胶束粒径发生了明显的增加。
[0070]实施例11
[0071]两种SN-38载药胶束的释药行为研究
[0072]为研究包裹了SN-38 的 mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cid^^束的释药行为，包裹了 SN-38的mPEG-Val-Cit-NH-C18载药胶束被制备用于释药行为的对照试验。分别取4mg包裹了 SN-38的mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cis和mPEG-Val-Cit-NH-Cis载药胶束溶解于1mL NaAc-HOAc缓冲溶液(25mM，pH 5.0)中，分别取2mL以上溶液加入到分子量为10000的透析袋中，其中一组加入50yL CB的NaAc缓冲溶液(50UI/mL)，另一对照组不加。之后置于1mL NaAc-HOAc缓冲溶液(25mM,pH 5.0)中于37°C摇床中透析，每过一天取出透析管中的1mL透析液并补充1mL NaAc-HOAc缓冲溶液(25mM，pH 5.0)。分别对0.4mg/mL的载药胶束溶液和从透析管中取出的溶液进行高效液相分析，计算释药量。如图4所示，结果表明，mPEG-Va 1-Cit-PABC-NH-C18载药胶束的释药速率要明显快于mPEG-Val-Cit-NH-C18载药胶束。
[0073]实施例12
[0074]为研究mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cis 胶束和包裹了 SN-38 的载药胶束 mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Ci8 的细胞毒性，空白胶束 mPEG-Val-Cit-NH-Cis 和包裹了 SN-38 的 mPEG-Val-Cit-順-&8载药胶束用于对照试验。细胞培养方法为:将处于对数生长期的HCT-116细胞，接种密度为5 X 103个细胞/孔/10yL接种于96孔板内，经细胞接种的96孔板放置在培养箱(37°C、5 % C02浓度的潮湿环境)中培养24h ο 24h后分别加入I OOyL不同浓度的mPEG_Val -Ci t_PABC_NH-Ci8 和 mPEG-Val-Cit-NH-Cis 空白胶束、包裹了SN-38 的载药胶束 mPEG-Val-Cit-PABC-NH-CisiPmPEG-Val-Cit-NH-Ci8以及SN-38，每个浓度均为三个复孔(另设无细胞空白孔、含细胞无药物对照孔)。然后再次放入培养箱培养72h后，从每孔中去除10uL旧培养液后加入浓度为5mg/mL的MTT溶液10uL，继续培养4小时后，吸去培养基并加入10yLDMSO溶解甲瓒晶体。然后用酶标仪(检测波长为570nm)测定每孔中溶液的吸光度(0D值)。按下列公式计算癌细胞的相对存活率。
[0075]细胞存活率(％) = (0D实验组-OD空白组/OD对照组-OD空白组)X 100%
[0076]如图5(A)和(B)所示，结果表明两种材料对HCT-116细胞的毒性均较小，但载药胶束mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18的细胞毒性要高于载药胶束HiPEG-Val-Cit-NH-C18，进一步证明了 mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cis 的释药速度要快于 mPEG-Val-Cit-NH-Cis。
【主权项】
1.一种组织蛋白酶B可裂解的嵌段聚合物，其特征在于，所述嵌段聚合物以二肽及PABOH为连接键，其结构式如式(I)所示: mPEG-Val-Cit-PABC-R2 式(I) 式(I)中，mPEG为甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物，R2为直链脂肪胺。2.根据权利要求1所述的嵌段聚合物，其特征在于，所述嵌段聚合物的结构式如式(II)所示， mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn 式(II); 式(II)中:mPEG甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物的平均分子量为1000-10000;Cn表示碳原子数，其中η为14-22。3.如权利要求1或2所述嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，所述方法为:(I)Fmoc保护的连接键Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP与长链脂肪胺Cn-NH2在DMAP的催化条件下反应，制得Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn; (2)在哌啶的作用下Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn脱去Fmoc的保护制得Val-Cit-PABC-NH-Cn; (3)脱保护后的Val-Cit-PABC-NH-Cn与甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物经过脱水缩合反应制得mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn。4.如权利要求3所述嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中，在二氯甲烷中，室温条件下反应36小时。5.如权利要求3所述嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反应溶剂为二甲基甲酰胺，反应温度为室温，反应时间为2小时。6.如权利要求3所述嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，脱保护后的Val-Ci t-PABC-NH-Cn与甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物在二甲基甲酰胺中，室温条件下，与EDC1、H0Bt和Et3N反应，经过脱水缩合反应24小时，制得mPEG-Va 1-Ci t-PABC-NH-Cn。7.如权利要求1所述的嵌段共聚物在制备胶束药物载体和/或实现药物在肿瘤细胞内的控制释放中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种组织蛋白酶B(CB)可识别并可降解的二肽及对氨基苄醇(PABOH)间隔基为连接键的嵌段共聚物的制备方法。(1)Fmoc保护的连接键Fmoc-Val-Cit-PABOH与长链脂肪胺共价结合制得Fmoc-Val-Cit-PABC-Cn；(2)脱去Fmoc的保护制得Val-Cit-PABC-Cn；(3)脱保护后的Val-Cit-PABC-Cn与甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物结合制得mPEG-Val-Cit-PABC-Cn所述嵌段共聚物，所述嵌段共聚物为两亲性的嵌段共聚物。其自组装形成的纳米载药胶束可实现增强的肿瘤细胞内的药物控制释放，细胞毒性较低，显示出了作为疏水性抗肿瘤药物载体的使用潜力。
【IPC分类】A61K31/4745, A61K9/127, A61P35/00, A61K47/34, C08G65/333
【公开号】CN105622924
【申请号】CN201610077702
【发明人】余家会, 安平, 徐艳昀, 曹丽
【申请人】华东师范大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年2月3日