本发明涉及发酵产物的提取工艺，具体涉及一种将原位萃取发酵产物进行粗分离的方法。
背景技术：
原位萃取发酵是指在微生物发酵培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物，使培养体系由于分配系数不同而形成上下两相。微生物细胞在其中一相生长，而代谢产物则被吸附富集到另一相中。通过原位萃取发酵，可以有效地减轻代谢产物对微生物的抑制作用，提高代谢产物的合成效率，同时避免代谢产物被培养基或菌体中的酶系等催化降解。在原位萃取发酵系统中，代谢产物在发酵过程中不断地被萃取累积，使得在发酵结束后有机相中就含有的产物浓度很高，简化了下游处理过程。因此，这种对细胞“非破坏性”的萃取过程，有利于连续发酵体系的构建。
原位萃取发酵在植物次生代谢产物如紫杉醇、藻类油脂发酵以及脂溶性化合物如类胡萝卜素、维生素a等产物发酵方面有着广阔的应用前进。但是为了便于好氧通气发酵的进行，选用的有机溶剂大多为高沸点溶剂，比如长链烷烃(c10以上)、长链烷烃醇酯等高沸点有机物。这些高沸点有机溶剂很难利用真空浓缩等技术去除，这就使得从有机相中分离回收代谢产物，以及回收有机溶剂变得较为困难，从而导致生产成本偏高，不易实现工业化生产。
技术实现要素：
本发明是为了解决上述代发酵产物分离困难、有机相溶剂回收率低的问题，目的在于提供一种原位萃取发酵中发酵产物粗分离的方法。
本发明提供的原位萃取发酵中发酵产物的粗分离方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一，将原位萃取发酵中获得的有机相取出，去除有机相中的固形杂质以及残余水分；
步骤二，将层析硅胶采用干柱法加入层析柱中，敲打使层析硅胶排列紧密；
步骤三，将除杂后的有机相按(10ml有机相)/(1g层析硅胶)-(100ml有机相)/(1g层析硅胶)的比例加入装配好的层析柱中，进行吸附分离；
步骤四，吸附分离结束后，将层析柱中残余的有机相排出；
步骤五，将去除有机相后的层析硅胶取出，切割下有色的层析硅胶，用于进一步分离纯化；
步骤六，收集层析柱下端的有机溶剂，该有机溶剂可回用于原位萃取发酵。
本发明提供的原位萃取发酵中发酵产物的粗分离方法，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，步骤一中采用离心的方法去除固形杂质以及残余水分。
本发明提供的原位萃取发酵中发酵产物的粗分离方法，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，步骤一中采用的离心速率为5000rpm。
本发明提供的原位萃取发酵中发酵产物的粗分离方法，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，步骤一中的有机相中使用的有机溶剂为c8-c16的长链烷烃、植物油、油醇、油酸、油酸丁酯、石蜡油中的一种或几种。
本发明提供的原位萃取发酵中发酵产物的粗分离方法，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，步骤二中层析硅胶的粒径为10μm-200μm。
本发明提供的原位萃取发酵中发酵产物的粗分离方法，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，步骤四中采用压缩空气将层析柱中残余的有机相排出。
本发明提供的原位萃取发酵中发酵产物的粗分离方法，还可以具有这样的特征，其特征在于：其中，原位萃取发酵为牛樟芝原位萃取发酵，发酵产物为antrodinc以及安卓奎诺尔等。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的一种原位萃取发酵中发酵产物的粗分离方法由于采用了层析的方法将有机相中的产物提取出来，因此与现有技术具有以下优点：
现有技术采用的是蒸馏浓缩的分离方法，与之相比本发明采用的分离方法具有工艺简单，分离速度快，代谢产物的回收率高，回收的有机溶剂中代谢产物等杂质含量极低，回收溶剂还可直接回用于原位萃取发酵等优点。
另外，本发明中所使用的的方法在室温处理，能耗小、安全性能高，且采用的层析硅胶价格低廉，生产成本较低，硅胶经过一定处理后也可以重复利用。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例对本发明提供的一种原位萃取发酵中发酵产物的粗分离方法的工作原理以及有益效果作具体阐述。
实施例1
步骤一，从牛樟芝原位萃取发酵液中分离出有机相十二烷溶液，采用5000rpm的速度离心去除十二烷溶液中的固形杂质以及残余水分。
步骤二，将粒径为200μm的层析硅胶用干柱法加入层析柱中，敲打使层析硅胶排列紧密。
步骤三，将除杂后的十二烷按照(10ml有机相)/(1g层析硅胶)的比例加入装好的硅胶层析柱中，进行吸附分离。
步骤四，吸附分离结束后，利用压缩空气将硅胶柱中残余的十二烷顶出。
步骤五，将去除十二烷后的硅胶取出，切割下有色的层析硅胶，该有色层析硅胶即为富含代谢产物的硅胶，用于进一步分离纯化。
步骤六，收集硅胶柱下端的十二烷，该收集到的十二烷即为回收的干净溶剂，可回用于原位萃取发酵。
采用实施例1的分离纯化方法后，牛樟芝活性成分如antrodinc、安卓奎诺尔等回收率达到92％，同时所回收的十二烷为无色、无味液体，可以重复用于牛樟芝原位萃取发酵。
实施例2
步骤一，从牛樟芝原位萃取发酵液中分离出有机相十二烷溶液，采用5000rpm的速度离心去除十二烷溶液中的固形杂质以及残余水分。
步骤二，将粒径为100μm的层析硅胶用干柱法加入层析柱中，敲打使层析硅胶排列紧密。
步骤三，将除杂后的十二烷按照(50ml有机相)/(1g层析硅胶)的比例加入装好的硅胶层析柱中，进行吸附分离。
步骤四，吸附分离结束后，利用压缩空气将硅胶柱中残余的十二烷顶出。
步骤五，将去除十二烷后的硅胶取出，切割下有色的层析硅胶，该有色层析硅胶即为富含代谢产物的硅胶，用于进一步分离纯化。
步骤六，收集硅胶柱下端的十二烷，该收集到的十二烷即为回收的干净溶剂，可回用于原位萃取发酵。
采用实施例2的分离纯化方法后，牛樟芝活性成分如antrodinc、安卓奎诺尔等回收率达到99％，同时所回收的十二烷为无色、无味液体，可以重复用于牛樟芝原位萃取发酵。
实施例3
步骤一，从牛樟芝原位萃取发酵液中分离出有机相十二烷溶液，采用5000rpm的速度离心去除十二烷溶液中的固形杂质以及残余水分。
步骤二，将粒径为10μm的层析硅胶用干柱法加入层析柱中，敲打使层析硅胶排列紧密。
步骤三，将除杂后的十二烷按照(100ml有机相)/(1g层析硅胶)的比例加入装好的硅胶层析柱中，进行吸附分离。
步骤四，吸附分离结束后，利用压缩空气将硅胶柱中残余的十二烷顶出。
步骤五，将去除十二烷后的硅胶取出，切割下有色的层析硅胶，该有色层析硅胶即为富含代谢产物的硅胶，用于进一步分离纯化。
步骤六，收集硅胶柱下端的十二烷，该收集到的十二烷即为回收的干净溶剂，可回用于原位萃取发酵。
采用实施例3的分离纯化方法后，牛樟芝活性成分如antrodinc、安卓奎诺尔等回收率达到98％，同时所回收的十二烷为无色、无味液体，可以重复用于牛樟芝原位萃取发酵。
实施例4
步骤一，从牛樟芝原位萃取发酵液中分离出有机相油酸溶液，采用5000rpm的速度离心去除油酸溶液中的固形杂质以及残余水分。
步骤二，将粒径为50μm的层析硅胶用干柱法加入层析柱中，敲打使层析硅胶排列紧密。
步骤三，将除杂后的油酸按照(50ml有机相)/(1g层析硅胶)的比例加入装好的硅胶层析柱中，进行吸附分离。
步骤四，吸附分离结束后，利用压缩空气将硅胶柱中残余的油酸顶出。
步骤五，将去除油酸后的硅胶取出，切割下有色的层析硅胶，该有色层析硅胶即为富含代谢产物的硅胶，用于进一步分离纯化。
步骤六，收集硅胶柱下端的油酸，该收集到的十二烷即为回收的干净溶剂，可回用于原位萃取发酵。
采用实施例4的分离纯化方法后，牛樟芝活性成分如antrodinc、安卓奎诺尔等回收率达到97％，同时所回收的油酸为无色、无味液体，可以重复用于牛樟芝原位萃取发酵。
实施例5
步骤一，从牛樟芝原位萃取发酵液中分离出有机相油酸溶液，采用5000rpm的速度离心去除油酸溶液中的固形杂质以及残余水分。
步骤二，将粒径为100μm的层析硅胶用干柱法加入层析柱中，敲打使层析硅胶排列紧密。
步骤三，将除杂后的油酸按照(50ml有机相)/(1g层析硅胶)的比例加入装好的硅胶层析柱中，进行吸附分离。
步骤四，吸附分离结束后，利用压缩空气将硅胶柱中残余的油酸顶出；
步骤五，将去除油酸后的硅胶取出，切割下有色的层析硅胶，该有色层析硅胶即为富含代谢产物的硅胶，用于进一步分离纯化。
步骤六，收集硅胶柱下端的油酸，该收集到的十二烷即为回收的干净溶剂，可回用于原位萃取发酵。
采用实施例5的分离纯化方法后，牛樟芝活性成分如antrodinc、安卓奎诺尔等回收率达到99％，同时所回收的油酸为无色、无味液体，可以重复用于牛樟芝原位萃取发酵。
实施例的作用与效果
根据本发明所涉及的一种原位萃取发酵中发酵产物的粗分离方法由于采用了层析的方法将有机相中的产物提取出来，因此与现有技术具有以下优点：
现有技术采用的是蒸馏浓缩的分离方法，与之相比本发明中代谢产物的回收率高，并且回收的有机溶剂中代谢产物等杂质的含量极低，工艺简单，分离速度快，可以直接重复用于原位萃取发酵。另外，本发明中所使用的的方法在室温处理，能耗小、安全性能高，且采用的层析硅胶价格低廉，生产成本较低，硅胶经过一定处理后也可以重复利用。
进一步的，从实施例1-5中可以看出，采用本发明的分离方法分离牛樟芝原位萃取发酵产物的产率均高达90％以上，且回收的有机溶剂为无色、无味液体可回用于原位萃取发酵。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。