专利名称：用于人类白细胞受体拮抗剂的筛选试验方法
技术领域：
本发明涉及具有抑制免疫感受态人类细胞中配体诱导的共同刺激受体摄入途径的能力的化合物的筛选方法、用于筛选所述化合物的试剂盒和能够阻断对配体诱导的受体的减量调节而由此防止配体诱导的受体摄入(LIRI)的免疫调节药物。
背景技术：
成熟T淋巴细胞的激活需要统称为共同刺激的抗原识别和次级信号(1)。目前认为通过单独的T细胞受体(TCR)进行的抗原识别不能激活T细胞，而能够诱导称作无反应性的无应答性状态。共同刺激途径的接合是使T细胞活化最优化必不可少的。在静息T细胞上表达的最佳表征的共同刺激受体是CD28。CD28与其配体CD80和CD86的相互作用在增加和维持通过TCR接合引起的T细胞反应中起决定性作用(2)。还证实了通过CD2/LFA3、CD40L/CD40、LFA-1/ICAM途径的共同刺激(3)。近来发现了4-1BB和ICOS起共同刺激分子的作用(4)。
对生物学家而言受体的摄入很久以来一直是有吸引力的课题(5)。尽管尚未完全阐明根本机理，但是已经积累了大量知识。已经注意到与特异性mAbs接合后共同刺激受体的摄入。近来更对CD28/B7、CD40/CD154途径报导了天然配体诱导的受体摄入(6)。
由于共同刺激信号在通过T细胞至T细胞活化或通过无反应性测定抗原识别的过程中是关键的，所以共同刺激在发生自身免疫反应中的作用是显而易见的。共同刺激信号提供了次级信号，它决定了TCR接合的结果，这是因为它们增加了T细胞增殖和效应细胞的功能，诸如细胞因子产生和细胞溶解。已经建议可以将在静息组织抗原呈递细胞(APCs)上不存在共同刺激物这一结果用于诱导并维持T细胞对自身抗原的耐受性且对APCs上共同刺激物的异常表达可以刺激自身反应性T细胞，从而产生自身免疫性。实际上已经证实对共同刺激的阻断改善了几种动物疾病模型中的自身免疫反应。证据还来源于“剔除”小鼠，其用于共同刺激分子的基因已经进行了遗传缺失，表明该小鼠不会发生或仅发生适度的自身免疫病。
由于共同刺激涉及人体内的炎症和自身免疫病，所以已经进行了大量研究来尝试通过阻断共同刺激途径改善异常反应。已经证实诸如单克隆抗体这样完全或遗传操作的针对受体或配体的各种大生物分子、结合受体的免疫球蛋白或可溶性配体在体外可有效抑制共同刺激且还从体内研究中获得了理想的结果(1)。
近来已经致力于鉴定能够减量调节携带有关特异性抑制共同刺激受体与其配体之间结合的病灶的共同刺激的小分子化合物。就鉴定这类化合物而言，已经使用了基于特征在于通过细胞表面受体的复杂分子装配的相互作用的分离的靶物或细胞相互作用的方法。
在预先已知的方法中，目前建立的方法一般仅部分基于细胞。例如，在闪烁亲近测定法(SPA)中，受体或它所居留的膜固定在含有示踪物的珠上或被该珠俘获且适宜的配体被放射性标记。当所述受体与所述示踪物结合时，它使放射性同位素足以接近该珠以刺激闪烁体发光。相反，如果未标记的配体或竞争性药物取代了受体结合位点上的示踪物，那么几乎没有放射性与所述珠结合且由此几乎不发光。因此，在平衡方面，可以探测能够与受体的放射性示踪物竞争的分子的存在。
然而，这些已有的方法存在不能预计测试化合物的体内功效和分子相互作用的缺陷。此外，它们耗时，因为它们需要表达步骤和蛋白质纯化。一般来说，这些方法还包括长时间与测试化合物的共同温育的步骤，这可能在结果中产生巨大的背景“噪声”，因为难以将测试化合物的毒性结果与其所需作用区分开来。
缩写表在文章其余的段落中使用下列缩写ACAS活化细胞分析与分选CHO中国仓鼠卵巢CD分化簇FCS胎牛血清FACS荧光活化细胞分选仪FTIC异硫氰酸荧光素HLA人类白细胞抗原ICAM细胞间粘着分子ICOS诱导型共同刺激物LFA白细胞功能抗原LIRI配体诱导的受体摄入PBMC外周血单核细胞PFA低聚甲醛PE藻红蛋白SEA葡萄球菌肠毒素ASPA闪烁亲近测定法发明内容本发明在第一个方面中涉及具有抑制免疫感受态人类细胞中配体诱导的共同刺激受体摄入途径的能力的化合物的筛选方法。在能够有至少一种测试化合物存在的情况下诱导共同刺激受体摄入的条件下温育所述的免疫感受态人类细胞且然后测定对配体诱导的共同刺激受体摄入的抑制。
在一种实施方案中，该方法的免疫感受态细胞是白细胞。在另一个实施方案中，所述的白细胞是淋巴细胞。在另一个实施方案中，所述的淋巴细胞是T-细胞。在另一个实施方案中，所述的T-细胞是Jurkat细胞。
在另一个实施方案中，所述的白细胞是抗原呈递细胞。在另一个实施方案中，所述的抗原呈递细胞是B-细胞。
在另一个实施方案中，所述的条件指的是与编码至少一种人类配体的DNA转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞一起培养所述的免疫感受态细胞。在另一个实施方案中，用编码至少一种人类配体或受体的DNA转染所述的CHO细胞，所述的人类配体或受体选自包括ICAM、CD54(LFA3)、CD40、CD80、CD86、CD154(CD40L)在内的组。
在该方法的另一个实施方案中，所述的测试化合物是一种低分子量化合物，它优选具有约达500的分子量。
在该方法的另一个实施方案中，使用流式细胞计量术或对细胞进行的聚焦显微镜分析来对所述的抑制进行所述的测定。
该方法对高含量筛选(HCS)或中等流通量筛选(MTS)而言优选是有利自动进行的。
在该方法的另一个实施方案中，所述的途径选自受体-配体对组成的组，所述的受体-配体对包括CD40/CD154(CD40L)、CD2/LFA3、CD28/CD80、CD86和CD11/ICAM。
本发明在另一个方面中涉及用于筛选具有抑制免疫感受态人类细胞中配体诱导的共同刺激受体摄入的能力的化合物的试剂盒，该试剂盒包括用于培养免疫感受态人类细胞的用具；用于诱导共同刺激受体摄入的用具；用于与至少一种测试化合物一起温育所述免疫感受态人类细胞的用具；用于标记所述受体的用具；和用于测定对配体诱导的共同刺激受体摄入的抑制的用具。
在所述试剂盒的一种实施方案中，将与同位素或荧光蛋白的缀合物用于标记所述受体。
在所述试剂盒的另一个实施方案中，将流式细胞计量术或聚焦显微镜用于测定对配体诱导的共同刺激受体摄入的抑制。
本发明在另一个实施方案中涉及免疫调节药物，它能够阻断对配体诱导的受体的减量调节，由此防止配体诱导的受体摄入。
在一种实施方案中，所述的免疫调节药物是一种低分子量化合物。在另一个实施方案中，该化合物具有约达500的分子量。
附图1.人类CD80和CD86诱导CD28受体的减量调节。
附图2.CD80诱导的CD28减量调节的剂量依赖性和时间过程。A将Jurkat细胞与不同数目的CHO/CD80细胞一起培养。B以51的比例将Hurkat细胞与CHO/CD8O一起温育不同时间。
附图3.LFA3(CD58)减量调节T细胞上CD2的表达。
附图4.人类CD40L和CD40彼此减量调节。A将人类B细胞系Ramos 2G6 4C10细胞与CHO转染子一起温育。B将CD40L+-Jurkat细胞与CHO/DR或CHO/DR/CD40细胞一起温育不同时间。
附图5.LFA3-和CD8O诱导CD2和CD28受体在人类PBMC中的减量调节。
附图6.人类ICAM1(CD54)减量调节CD11α(LFA-1)且αICAM1mAb阻断这种作用。
附图7.用mAbs预处理CHO/CD80的CD80或Jurkat上的CD80阻断了CD80诱导的CD28减量调节。A将CHO/CD80转染子与αCD80mAb或对照mAb一起温育。B将Jurkat细胞与αCD28 mAb一起温育。
附图8.用αCD40 mAb预处理CHO/CD40或Raji细胞。
附图9.阻断共同刺激受体减量调节的mAbs也阻断T细胞活化。A用不同浓度的αCD28 mAb预处理的Jurkat细胞或与CHO/DR/CD80转染子和超抗原SEE共同培养的对照mAb。B用αCD2 mAb预处理的Jurkat细胞或与CHO/DR/LFA3转染子共同培养的对照mAb。
附图10.胞内染色证明受体在与配体相互作用后摄入。A将Jurkat细胞与CHO/LFA3或CHO/CD40一起培养。B培养条件和胞内染色过程与A中相同。
附图11.物质L特异性抑制配体A诱导的受体A的减量调节。
附图12.CTLA-4在人类T细胞上的诱导。用SEE(5nM)将人类PBMC激活72小时并通过FACS进行表型分析。
附图13.CD80减量调节SEE激活的人类PBMC上的CTLA-4表达。将已经用SEE(5nM)激活72小时的人类PBMC与CHO/CD80一起混合并温育30分钟。通过FACS分析CTLA-4的表达。
发明详述共同刺激在人类T淋巴细胞和B淋巴细胞活化中起决定性作用。对共同刺激途径的阻断例如可以改善特征在于异常T细胞和B细胞活化的自身免疫病。
进行的观察结果证实配体与受体之间的相互作用不可避免地导致受体以特定和高敏感性方式摄入。例如针对所述受体或所述配体的单克隆抗体这样的竞争结合剂的加入防止了配体诱导的受体摄入(LIRI)。
本发明包括用于发现人类白细胞上共同刺激受体拮抗剂的的新筛选方法。该方法例如基于流式细胞计量术分析且可以通过该试验方法筛选大量化合物。例如，已经通过该方法发现了一种低分子量化合物，即物质L，它是具有321.39分子量的蝶啶衍生物、它可特异性阻断配体诱导的受体减量调节。
将通过特异性抑制LIRI的该试验方法发现的化合物看作免疫调节药物的候选物。
目前已经证实以物质L为典型的小分子量化合物特异性抑制LIRI。第一个观察结果是小分子量化合物能够阻断天然配体诱导的膜结合受体摄入。这一结果表明了该方法在筛选测试化合物中的实用性。
本发明的方法使用完整的活细胞而不是属于筛选化合物常用方式的分离靶物或细胞制备物。通过使用本发明的方法可以考虑到特征在于通过细胞表面受体的复杂分子装配发生相互作用的细胞-细胞相互作用的复杂性。可以通过测定生物性能和功能来预测测试化合物的功效。
此外，可以在细胞的天然范围内评价分子相互作用，可以鉴定毒性和非特异性作用且可以区别对选择细胞类型的药物作用。完整细胞试验避免了蛋白质纯化和表达步骤，否则就需要这些步骤。
本发明方法的短共同温育时间还减少了化合物测试过程中毒性的影响，否则可以在结果中产生背景“噪声”。
具体实施例方式
材料和方法细胞在补充了2mM谷氨酰胺和10％FCS的RPMI 1640中培养人类Jurkat T淋巴细胞系。通过FACS分类建立Jurkat亚系CD40L+Jurkat(＞95％阳性)和CD40L-Jurkat(＞99％阴性)并在相同条件下培养。
通过用SEA(5nM)刺激人类PBMC建立人类SEA维持的T细胞系且每隔5天改变一次SEA补充的培养基。
在补充了10％FCS的RPMI 1640中培养人类B细胞系Ramos 2G64C10。
用编码人类HLA-DR4、ICAM-1、CD8O、CD86、LFA-3(CD58)、CD40和CD40L(CD154)的cDNA转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞并将该细胞系维持在选择培养基中。用于本研究的转染子细胞系是HLA-DR4、CHO-CD28、CHO/LFA3、CHO-CD40、CHO-CD40L、CHO-ICAM1、CHO-DR4-CD80-LFA3。
试剂使用下列单克隆抗体(mAbs)αCD2-FITC(30045X，PharMingen)、αCD3-FITC(30140X，PharMingen)、αCD11a-PE(30425X，PharMingen)、αCD28(克隆CD28.2，Immunotech)、αCD28-FITC(33744X，PharMingen)、αCD28-PE(38047X，BectonDickinson)、αCD40L(33585X，PharMingen)、αCD40-FITC(22074X，PharMingen)、αCD80-PE(34029X，BectonDickinson)、αCD86-PE(33435X，PharMingen)、αLFA3-FITC(AHS5808，BioSource)、αICAM-PE(31625X，PharMingen)、αHLA-DR-PE(347367，Becton Dickinson)、山羊-αmIgG1-FTIC(M32101，CALTAG)和家兔-αmIg-FTIC(FO261，DAKO)。
合成了物质L，即具有321.39分子量的蝶啶衍生物。
细胞培养物在37℃下和5％CO2气中将Jurkat细胞(1×106/ml)与CHO转染子(2×105/ml)在12×75mm培养管(Falcon 2052)中一起培养不同时间。为了观察单克隆抗体或物质对LIRI的作用，在37℃下将CHO转染子或Jurkat细胞与相应的mAbs或物质一起温育30分钟且然后与Jurkat细胞或CHO转染子一起培养。
利用分选(ACAS)测定法进行的流式细胞计量术和贴壁细胞分析在培养后用磷酸缓冲盐水(PBS)将细胞洗涤一次并在4℃下以0.5×106/50μl的细胞密度用荧光缀合抗体染色30分钟。将细胞洗涤两次并重新悬浮于PBS中。在进行FACS试验前，将细胞维持在4℃下。用FACSort(Becton Dickinson)对细胞样品进行试验并用Cell Quest(Becton Dickinson)软件进行分析。还用交互式激光细胞计数器(ACAS 570，Ameridian)分析了部分细胞样品。
实施例1CD80和CD86诱导CD28的减量调节人类T细胞表达细胞表面上的CD28受体且该受体与配体CD80或CD86的结合构成了T细胞活化所必需的共同刺激信号。将人类T细胞系Jurkat细胞和用所述配体转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用于观察所述受体的命运。在共同温育30分钟后，洗涤细胞并用缀合了PE的αCD28 mAb染色。FACS分析结果显示CD80强力诱导CD28的减量调节且CD86具有较低的能力。对照细胞系CHO-DR不会干扰所述受体的表达(附图1)。
为了研究CD28的减量调节是否与温育系统中配体的数目有关，将Jurkat细胞(0.5×106/ml)与不同数目的CHO/CD80细胞一起温育30分钟，使得Jurkat细胞与CHO/CD80之比为2.5-10∶1。结果清楚地显示了细胞表面上CD80配体较多而CD28受体较少(附图2A)。对照细胞系(CHO/DR)甚至在较高的细胞数目下也决不会减量调节CD28的表达。
另一组实验表明CD80可迅速诱导CD28的减量调节。按5∶1的比例将Jurkat细胞与CHO/CD80一起温育不同时间。在温育后收集细胞并利用FACS进行分析。在共同温育30分钟后，约70％的表面CD28受体被摄入。甚至当混合两种类型的细胞并立即离心且染色(时间“0”)时，已经有15％左右的受体被摄入(附图2B)。就了解的情况而言，这是首次证实CD28通过结合到天然配体CD80上而如此迅速被摄入。
实施例2LFA3(CD58)诱导CD2的减量调节T细胞上的CD2与APC细胞上的LFA3之间的相互作用对T-APG细胞与细胞的粘着和T细胞共同刺激起重要作用。在该实验中，我们证实了LFA3在受体水平上减量调节CD2的表达。将Jurkat细胞与用不同人类分子转染的CHO细胞共同温育30分钟。在温育后收集细胞、用αCD2-PE染色并在用FACS进行分析。当仅用LFA3转染时，CHO转染子诱导CD2的减量调节(附图3)。转染入CHO细胞的其它人类分子不会干扰CD2的表达。CHO/LFA3转染子不会干扰CD28或其它T细胞受体的表达。LFA3诱导的CD2减量调节通常比CD80诱导的对CD28表达的减量调节更为显著。作为我们在文献中已经检索的结果，这是对由其天然配体LFA3所诱导的CD2摄入的第一次观察。
实施例3CD40和CD40L诱导彼此的减量调节CD40L/CD40途径是T和B细胞活化的另一个共同刺激途径且涉及人体自身免疫病。将人类B细胞系Ramos 2G6 4C10与CHO/CD40L或对照转染子一起温育2小时且然后利用FAGS分析CD40的表达。在温育后，观察CD40的减量调节(附图4A)，以及例如CD80、CD86、LFA3、ICAM-1这样的其它粘着分子的增强的表面表达。
另一方面，在与CHO/CD40一起温育不同时间后Jurkat细胞上CD40L的表达被显著减少。在温育后利用FACS分析CD40L的表达。附图4B中的结果表明共同温育后1小时Jurkat细胞上CD40L的表达减少至约80％。
实施例4配体诱导的初级细胞上受体的减量调节我们已经使用人类细胞系研究了受体调节。将SEA刺激的人类外周血单核细胞(PBMC)与用不同人类分子转染的CHO细胞一起温育30分钟。将细胞用αCD2-PE或αCD28-PE染色并用FACS分析。来自附图5的结果表明人类初级T细胞上的受体也受到所述配体的减量调节。使用超抗原SEA维持人类PBMC培养物。2-3周后，99％以上的细胞是CD3+CD8+和CD2+CD28+。当将这些细胞与CHO/DR转染子一起培养时，CD2或CD28的表达均没有受到影响(附图5)。在含有CHO/LFA3转染子的培养物中CD2的表达受到减量调节且CD28的表达因所述细胞与CHO/CD80接触而受到减量调节。没有观察到交叉反应，即在Jurkat/CHO系统中已经证实的特异性。
然后将人类SEA刺激的PBMC与CHO转染子或表达CD54的人类B细胞系Raji细胞共同温育30分钟。在4℃下将部分CHO细胞和Raji细胞用αICAM-1单克隆抗体预处理30分钟并洗涤两次。在共同温育后，用αCD11α-PE染色细胞并分析CD11α表达。附图6表示SEA刺激的T细胞上人类CD11α(LFA-1)受到配体CD54(ICAM-1)-转染的CHO细胞的中度减量调节。Raji细胞还诱导CD11α的减量调节。两细胞系在用αCD54 mAb预处理后均失去了这种能力，这是CD11α和CD54的连接诱导CD11α减量调节的强有力证据。就我们了解的情况而言，是我们首先报导了CD54诱导CD11α在人体中的减量调节。
实施例5受体减量调节的阻断我们已经证实受体与配体的相互作用导致受体摄入，它是活化信号转导的先决条件。在理论上，能够阻断这种相互作用的试剂会自然阻断配体诱导的受体摄入。在本实验中，我们证实识别受体CD28或配体CD80的mAbs能够抑制LIRI(附图7)。
在4℃下将CHO/CD80与αCD80 mAb或对照mAb一起温育30分钟。将细胞洗涤2次并在37℃下与Jurkat细胞共同温育30分钟。用FACS分析CD28受体的表达。
然后在4℃下将Jurkat细胞与αCD28 mAb一起温育30分钟。洗涤2次后，在37℃下将Jurkat细胞与CHO/DR或CHO/CD80共同温育30分钟。在4℃下再次将该细胞与饱和αCD28 mAb浓度(10μg/ml)一起再温育30分钟。在洗涤后用缀合了FITC的家兔抗小鼠Ig染色细胞。用FACS分析总CD28受体的表达。
当用αCD28处理CHO/CD80(附图7A)或用αCD28 mAb预处理Jurkat细胞(附图7B)时，抑制了受体摄入。换句话说，更多的试剂保留在Jurkat细胞上。对照mAbs没有表现出任何作用。
将CHO/CD40和Raji细胞用鼠抗人类CD40 mAb(5μg/ml)或对照mIgG预处理30分钟。然后将CD40L+Jurkat细胞与预处理的细胞一起温育30分钟。用FACS分析CD40L+Jurkat细胞上CD40L的表达。用αCD40 mAb预处理CHO/CD40或Raji细胞降低了CD40诱导CD40L减量调节的能力(附图8)。
实施例6T细胞活化的阻断当在有SEA存在的情况下与CHO/DR/CD80一起培养时，Jurkat细胞被完全激活而产生最重要的T细胞生长因子之一IL-2。在该培养系统中，SEA与HLA-DR分子结合且在CHO/DR/CD80细胞表面上形成SEA-DR复合物。Jurkat细胞表面上的CD3/TCR识别该复合物且这两部分的相互作用构成了T细胞的第一个活化信号。共同刺激信号对通过CD28(Jurkat细胞表面上)与CD80(CHO/DR/CD80上)之间结合而完成的完全T细胞活化而言是必不可少的。
将用不同浓度的aCD28 mAb或对照mAb预处理的Jurkat细胞与CHO/DR/CD80转染子和超抗原SEA(5nM)共同培养18小时。用ELISA测定培养物上清液中释放的IL-2。
将用αCD2 mAb或对照mAb预处理的Jurkat细胞与CHO/DR/LFA3转染子共同培养18小时。用ELISA测定上清液中的IL-2。
如果用已经证实能够阻断配体诱导的受体摄入的mAbs预处理Jurkat细胞，那么T细胞活化会受到影响。αCD28 mAb总体上消除了Jurkat-CHO/DR/CD80系统中IL-2的产生且αCD2 mAb也以剂量依赖性方式抑制了Jurkat-CHO/DR/LFA3系统中T细胞的活化。对照mAb(αEMBP)不会干扰各系统中T细胞活化(附图9)。针对配体CD80或LFA3的mAbs也减少了IL-2的产生，不过是以有效力较低的方式。
实施例7与配体相互作用后共同刺激受体的摄入由配体诱导的人类淋巴细胞上的表面受体的减量调节是一个复杂过程且隐含的机制尚未完全得到阐明。在本实验中，我们证实CD2和CD40L在与所述配体相互作用后摄入。
将Jurkat细胞与CHO/LFA3或CHO/CD40一起培养1小时。在用4％PFA将细胞的培养物部分固定后，用0.1％的皂苷渗透该培养物并用αCD2或αCD40L mAbs染色。表示出细胞中保留的受体百分比。表示出阳性细胞的频率。
就CD2而言，在与其配体一起温育后表面表达被减少至70％，而就CD40L而言，则减少至80％。细胞被渗透至使进入的mAbs与胞内受体结合。在渗透后，CD2和CD40L的表达分别增加了约60％，这是受体摄入(也称作胞吞作用)导致表面受体消失的有力证据(附图10A)。Jurkat细胞不会在胞内表达各受体(数据未显示)。80％以上的CD40L+-Jurkat细胞表达表面CD40L且仅有约30％的细胞在配体结合后保持阳性。渗透后，αCD40L染色显示60％以上的细胞是CD40L阳性的(附图10B)。
实施例8物质L阻断配体A诱导的受体A的减量调节已经证实具有约321.39分子量的蝶啶衍生物可从生物化学筛选程序中阻断受体与其配体之间的结合。在现存的系统LIRI系统中测试该物质。
将Jurkat细胞与CHO/配体A或CHO/配体B转染子共同温育15分钟，其中添加不同浓度的物质L。用FACS分析受体A(含有CHO/配体A的培养物中)与受体B(含有CHO/配体B的培养物中)的表达。
结果证明通过用物质L预处理含有配体A的CHO细胞而以剂量依赖性方式抑制了配体A诱导的受体A的减量调节或更多的受体A保留在与含有该配体的用所述物质预处理的CHO细胞一起温育后保留在细胞表面。物质L不会干扰配体B诱导的受体B的减量调节(附图11)。
实施例9人类CD80诱导CTLA-4的减量调节材料和方法细胞培养物人类外周血单核细胞(PBMC)分离自淡黄色表层并用补充了10％胎牛血清和SEE(5nM)的RPMI培养72小时。为了研究配体CD80对CTLA-4的调节，在37℃下将SEE活化的细胞与CHO/CD80转染子按5∶1的比例一起温育30分钟。洗涤细胞并用PE缀合的αCTLA-4(PharMingen，Cat.No.555853)染色且用FACS分析。
结果CD80减量调节CTLA-4人类静息T细胞不表达细胞表面上的CTLA-4(数据未显示)。在用SEE激活后，人类PBMC不能按照细胞大小分裂成2组。来自附图12的结果表明高达80％的大细胞表达CTLA-4且其它T活化标记(CD25、CD56、CD69)的表达增加。小细胞保留相似的表型作为静息PBMC。
在活化后，将PBMC细胞与CHO/CD80细胞混合并再温育30分钟。用FACA分析对GTLA-4的调节。附图13中的结果表明CD80减量调节CTLA-4的表达。来自平行培养物的结果表明CD80和LFA3转染子也分别减量调节CD28和CD2且LFA3不能减量调节CTLA-4的表达(数据未显示)。这些结果证实通过与反受体CD80的相互作用也可以减量调节诱导型人类T细胞共同刺激受体CTLA-4且在对CTLA-4的调节中也存在严格的特异性。
参考文献1.Tivol，AE等“共同刺激与自身免疫”-《最新免疫学观点》(Current Opinion in Immunology)8，pp 822-830(1996)。
2.June，CH等“CD28受体在T细胞活化中的作用”-《今日免疫学》(Immunology Today)11，pp 211-216(1990)。
3.Wingren，AG等“T细胞活化途径B7、LFA-3和ICAM-1形成独特的T细胞轮廓”-《免疫学标准综述》(Crit Rev Immunol)15，pp 235-253(1995)。
4.Melero，I等“针对4-1 BB T细胞活化分子的单克隆抗体可根除建立的肿瘤”-《天然药物》(Nature Medicine)6，pp 682-685(1997)。
5.Marsh，M等“胞吞作用的结构代”-《科学》285，pp 215-220(1999年7月)。
6.Eck，SC等“B7-1和B7-2接合对CD28的差异减量调节”-《移植》64，pp 1497-1499(1997年11月)。
权利要求
1.具有抑制免疫感受态人类细胞中配体诱导的共同刺激受体摄入途径的能力的化合物的筛选方法，其特征在于在能够有至少一种测试化合物存在的情况下诱导共同刺激受体摄入的条件下温育所述的免疫感受态人细胞；并测定对配体诱导的共同刺激受体摄入的抑制。
2.权利要求1的方法，其中所述的免疫感受态细胞是白细胞。
3.权利要求2的方法，其中所述的白细胞是淋巴细胞。
4.权利要求3的方法，其中所述的淋巴细胞是T-细胞。
5.权利要求4的方法，其中所述的T-细胞是Jurkat细胞。
6.权利要求2的方法，其中所述的白细胞是抗原呈递细胞。
7.权利要求6的方法，其中所述的抗原呈递细胞是B-细胞。
8.权利要求1-7中任意一项的方法，其中所述的条件指的是与用编码至少一种人类配体的DNA转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞一起培养所述的免疫感受态细胞。
9.权利要求8的方法，其中用编码至少一种人类配体或受体的DNA转染所述的CHO细胞，所述的人类配体或受体选自包括ICAM、CD54(LFA3)、CD40、CD80、CD86、CD154(CD40L)在内的组。
10.权利要求1-9中任意一项的方法，其中所述的测试化合物是一种低分子量化合物。
11.权利要求10的方法，其中所述的测试化合物具有约达500的分子量。
12.权利要求1-11中任意一项的方法，其中使用流式细胞计量术或对细胞进行的聚焦显微镜分析来对所述的抑制进行所述的测定。
13.权利要求1-12中任意一项的方法，该方法对高含量筛选(HCS)或中等流通量筛选(MTS)而言是自动进行的。
14.权利要求1-13中任意一项的方法，其中所述的途径选自由受体-配体对组成的组，所述的受体-配体对包括CD40/CD154(CD40L)、CD2/LFA3、CD28/CD80、CD86和CD11/ICAM。
15.用于筛选具有抑制免疫感受态人类细胞中配体诱导的共同刺激受体摄入的能力的化合物的试剂盒，该试剂盒包括用于培养免疫感受态人类细胞的用具；用于诱导共同刺激受体摄入的用具；用于与至少一种测试化合物一起温育所述免疫感受态人类细胞的用具；用于标记所述受体的用具；和用于测定对配体诱导的共同刺激受体摄入的抑制的用具。
16.权利要求15的试剂盒，其中将与同位素或荧光蛋白的缀合物用于标记所述受体。
17.权利要求15或16的试剂盒，其中将流式细胞计量术或聚焦显微镜用于测定对配体诱导的共同刺激受体摄入的抑制。
18.免疫调节药物，它能够阻断对配体诱导的受体的减量调节，由此防止配体诱导的受体摄入。
19.权利要求18的免疫调节药物，它是一种低分子量化合物。
20.权利要求18或19的免疫调节药物，它是具有约达500的分子量的化合物。
全文摘要
本发明描述了具有抑制免疫感受态人类细胞中配体诱导的共同刺激受体摄入途径的能力的化合物的筛选方法。在能够有至少一种测试化合物存在的情况下诱导共同刺激受体摄入的条件下温育所述的免疫感受态人类细胞并测定对配体诱导的共同刺激受体摄入的抑制。本发明还描述了用于这类方法的试剂盒以及能够阻断对配体诱导的受体的减量调节的免疫调节药物。
文档编号G01N33/48GK1481504SQ0182106
公开日2004年3月10日 申请日期2001年12月20日 优先权日2000年12月22日
发明者徐震逸, K·M·E·米施尔森, L·比特森, P·索伦森, E 米施尔森, 厣, 咨 申请人:活跃生物技术股份公司