专利名称：一种鱼类病毒的检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及淋巴囊肿病病毒(Lymphocystic Disease Virus China，LCDV-cn)的一种核酸探针斑点杂交试剂盒及其检测技术，具体说是一种鱼类病毒的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
LCDV-cn病毒是一种可以感染多种鱼类的DNA型病毒，我国山东、河北、广东等省的养殖海水鱼都遭受其害。据报道，该病最早在欧洲被发现，至今已有上百年的历史。其感染症状是在鱼的体表、口唇、鳃和鳍条等处，出现若干形似菜花的肿瘤，病鱼外观丑陋，死亡率上升，商业价值大大下降，造成的经济损失非常严重。而且该病毒具有隐性感染的特点，侵入鱼体内可潜伏两个月以上，并不表现出肉眼可见的症状。而一旦出现症状，则病情加重，加之还没有理想的药物，所以造成的后果是严重的。因此，通过对亲鱼和鱼苗的早期检测，去除携带病毒的鱼，就可以做到切断传染、减少流行，保障鱼类的健康养殖。但是迄今为止，尽日本北海道大学吉水守教授建立了淋巴囊肿病毒的ELISA检测方法，该方法可以定性、定量病毒，但作为早期、微量检出，其灵敏度则远远不足。核酸探针-斑点杂交技术是一种快捷的基因诊断技术。根据杂交膜上点状斑点的有无和强弱，可以判断样品是否染毒、还可以半定量病原。国内，点杂交技术在对虾疾病诊断中的应用较多。Lo等(1999)、史成银等(1999)和徐洪涛等(2000)，利用此方法检测对虾白斑综合症(WSSV)。中国水产科学院黄海水产研究所病害室研制出了“对虾爆发性流行病原核酸探针-点杂交诊断试剂盒”，但点杂交应用于养殖鱼类病毒病的检测尚未有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种鱼类病毒的检测试剂盒及其检测方法，以便早期和更方便地检测出LCDV-cn感染的鱼，尤其是对鱼苗和亲鱼的早期检测，以避免该病毒感染造成的损失。
本发明采用核酸探针-斑点杂交技术，它是在核酸水平上的一种检测技术，具有准确性好、灵敏度高的特点。其原理是利用LCDV-cn的DNA是一种双链结构核酸和热变性及复性的特点(即在加热的条件下，DNA可由双链变成单链；而在适当条件下，也可由单链变成双链)，只要其碱基序列相同，变性后不同来源的两条DNA单链都可以相互杂交。根据这一DNA杂交的原理，采用国家海洋局第一海洋研究研制的地高辛标记特异性核酸探针液，进行斑点杂交就可以检测出LCDV-cn。
本发明的检测试剂盒为底面有延伸舌(部)的方形盒体，盒体内上设有插入内盛溶液的、多种瓶体的圆孔，并置放于外包装盒中。瓶体内的溶液包括洗液、缓冲液各3种；对照液、显色液各2种以及封闭液、抗体液、探针液、研磨液各1种，并注入在内盒体的14只容器(瓶)中。盒体底面延伸舌上可放置备用的附件，如杂交膜、杂交袋、薄壁管和研磨棒。
本发明的检测方法是先取待测鱼组织(为了尽量少伤害鱼类，建议剪取0.05-0.1克鳍条)，在研磨液C中充分研磨；然后取其上清液，待变性后点样于一张杂交膜上；该膜在交联和预杂交后，与变性后的探针液K杂交；然后分别用洗液D、洗液B清洗，再与抗体液L进行免疫反应；再经洗液A洗净后，与显色液NBT/BCIP进行显色反应，最后检查并记录杂交膜上的显色结果。点样处出现蓝色斑点的相对应的鱼组织，视为被LCDV-CN病毒感染；否则，其对应的鱼组织未被LCDV-CN病毒感染。
图1为本发明的总体结构示意图。
图2为本发明的盒体俯视图。
其中1、盒体；2、瓶；3、杂交袋；4、杂交膜；5、研磨棒；6、离心(薄壁)管；7、圆孔。
具体实施例方式如图1、图2所示，本发明的检测试剂盒为底面有延伸舌(部)的方形盒体(1)，盒体(1)上面布设着内盛溶液的多种瓶体(2)的圆孔。盒体(1)底面延伸舌上可置放备用的附件，如杂交膜(4)、杂交袋(3)、薄壁管(6)和研磨棒(5)。其瓶体内的溶液包括洗液，缓冲液各3种，对照液、显色液各2种以及封闭液、抗体液、探针液、研磨液各1种，并置放在内盒体的相应14只容器(瓶)中。本发明的盒体内装有以下物品A瓶(洗液A，25ml)；B瓶(洗液B，20ml)；C瓶(样品研磨液C，5ml)；D瓶(洗液D，5ml)；E瓶(缓冲液E，5ml)；F瓶(缓冲液F，5ml)；G瓶(缓冲液G，3ml)；H瓶(封闭液H，1ml)；I瓶(阳性对照液I，10ul)；J瓶(阴性对照液J，10ul)；K瓶(探针液K，10ul)；L瓶(抗体液L，10ul)；M瓶(显色液M，3ul)；N瓶(显色液N，4ul)。另外还有北京鼎国生物有限公司等生物公司制的多个附件，包括多张杂交膜，多个杂交袋和多根研磨棒，以及若干支0.5ml薄壁管。
按盒内字母顺序标识的溶液及成份如下表
具体操作步骤如下
1、处理样品用消毒刀片(手术刀片，刮胡刀片等均可)切取待测鱼组织50-100mg，放入备用的薄壁管中，加入100-200ul样品研磨液C，用研磨棒将其研碎，静置约2分钟，使沉淀下沉；2、取上述研磨液中的上清液各10微升注入薄壁管中，再加入阳性对照液I和阴性对照液J，在100℃沸水中水浴5-10分钟，迅速置于冰水浴中充分冷却，使鱼组织内的病毒释放出来，并利用热变性再骤冷的方式，使病毒的DNA结构由双链变为单链；3、点样取1ul(2、的)上清液，点样於杂交膜上的小格中，自然晾干(注意点样量不要过大，以防相邻的样品间相互渗透)；4、交联将点样后的杂交膜夹在两层滤纸之间，在120℃烘箱中烘烤半小时，将变性后的单链DNA固定到杂交膜上；5、预杂交再将杂交膜置于预杂交袋中，加入1-2ml缓冲液G，用封口机封口，62-70℃水浴中孵育半小时；6、探针液变性将探针液K(连同容器一起)，100℃沸水浴5分钟，迅速置于冰水浴中使其充分冷却，以将探针液变性，使探针液中的DNA结构由双链变为单链；7、杂交剪开第5步的预杂交袋，加入第6步处理后的溶液K，水浴中杂交6-16小时以保证上述让单链探针与固定在杂交膜上的单链样品进行杂交；8、洗膜将杂交膜取出、放入新的杂交袋中，用2ml洗液D清洗一次以上洗；将杂交膜再取出、放入新的杂交袋中，在62-70℃条件下，用10ml洗液B，再清洗一次以上，以将膜上未杂交的探针液洗掉；9、免疫反应将上述杂交膜取出放入一新的杂交袋中，加入2ml缓冲液E，加入200ul封闭液H，放置三十分钟；剪开上述杂交袋一角，加入1/50体积的抗体液L，密封，放置30分钟使抗体液与探针液里的地高辛发生免疫反应；10、洗膜将杂交膜取出、放入一新的杂交袋中，用10ml洗液A洗1次以上；再用2ml缓冲液F浸洗1-2分钟，以将未结合的抗体洗掉；11、显色将杂交膜取出、放入一个新的杂交袋中。加入1ml缓冲液F，再加入3ul显色液M和4ul显色液N，於暗室中放置2-12小时(中间不要搅动)。显色的时间，以杂交膜上未点样的空白处不出现变色为准，空白处一旦出现变色、应采取下一步以立即中止反应；12、中止反应用大量水冲洗上述杂交膜5-15分钟，中止显色反应；13、记录结果如果待测样品中有LCDV-cn病毒，则杂交膜上的点样处会出现或深或浅的蓝色斑点，阳性对照液I点样处，应出现蓝色的斑点；阴性对照液J点样处，不会出现蓝色斑点。在所测样品中，没有显色的样品为正常鱼，而出现蓝色斑点的样品是已被LCDV-cn感染的鱼，其蓝色越深、说明感染的程度越大。若要保存杂交膜，则可将膜夹在滤纸中令其干燥后再保存。
权利要求
1.一种鱼类病毒的检测方法，其特征是先取待测鱼组织，在研磨液C中充分研磨；然后取其上清液，待变性后点样于一张杂交膜上；该膜在交联和预杂交后，与变性后的探针液K进行杂交反应；然后分别用洗液D，洗液B清洗，再与抗体液L进行免疫反应；再经洗液A清洗后，与显色液NBT/BCIP进行显色反应，最后检查并记录杂交膜上的显色结果。点样处出现蓝色斑点的相应鱼组织，则已被LCDV-CN病毒感染，否则，其对应的鱼组织未被LCDV-CN病毒感染。
2.一种鱼类病毒的具体操作步骤是(1)处理样品用消毒刀片切取待测鱼组织50-100mg，放入备用的薄壁管中，加入100-200ul样品研磨液C，用研磨棒将其研碎，静置约2分钟，使沉淀沉下；(2)取上述研磨液中的上清液各10微升注入薄壁管中，再加入阳性对照液I和阴性对照液J，在100℃沸水浴5-10分钟，迅速置于冰水浴中充分冷却；(3)点样取1ul上清液，点样于杂交膜上的小格中，自然晾干；(4)交联将点样后的杂交膜夹在两层滤纸之间，在120℃烘箱中烘烤半小时；(5)预杂交再将杂交膜置于预杂交袋中，加入1-2ml缓冲液G，用封口机封口，62-70℃水浴中孵育半小时；(6)探针液变性将探针液K(连同容器一起)，100℃沸水浴5分钟，迅速置于冰水浴中使其充分冷却；(7)杂交剪开第5步的预杂交袋，加入第6步处理后的溶液K，水浴中杂交6-16小时；(8)洗膜将杂交膜取出、放入新的杂交袋中，用2ml洗液D清洗一次以上洗；将杂交膜再取出、放入新的杂交袋中，在62-70℃条件下，用10ml洗液B，再清洗一次以上，以将膜上未杂交的探针液洗掉；(9)免疫反应将上述杂交膜取出放入一新的杂交袋中，加入2ml缓冲液E，加入200ul封闭液H，放置三十分钟。剪开上述杂交袋一角，加入1/50体积的抗体液L，密封、放置30分钟；(10)洗膜将杂交膜取出、放入一新的杂交袋中，用10ml洗液A洗一次以上；再用2ml缓冲液F浸洗1-2分钟；(11)显色将杂交膜取出、放入一个新的杂交袋中，加入1ml缓冲液F，再加入3ul显色液M和4ul显色液N，於暗室中放置2-12小时；(12)中止反应用大量水冲洗上述杂交膜5-15分钟，中止显色反应并记录结果。
3.一种鱼类病毒的检测试剂盒，其特征是检测试剂盒为底面有延伸舌的方形盒体(1)，盒体(1)上面有布设内盛溶液的多种瓶(2)体的圆孔，盒体(1)底面延伸舌上可置放备用的附件，如杂交膜(4)、杂交袋(3)、薄壁管(6)和研磨棒(5)，其瓶体内的溶液包括洗液，缓冲液各3种，对照液、显色液各2种以及封闭液、抗体液、探针液、研磨液各一种，并置放在内盒体(1)的相应的14只瓶(2)中。
4.如权利要求3所述的一种鱼类病毒的检测试剂盒，其特征是上述探针液含地高辛标记的LCDV-cn特异性核酸探针。
全文摘要
一种鱼类病毒的检测试剂盒及其检测方法，盒体上面有布设内盛溶液的、多种瓶体的圆孔，盒体底面延伸舌上可置放备用的附件，如杂交膜、袋等，14只瓶内有洗液，缓冲液各3种，对照液、显色液各2种以及封闭液、抗体液、探针液、研磨液各一种。方法是先取待测鱼组织，在研磨液C中充分研磨；然后取其上清液，待变性后点样于一张杂交膜上；该膜在交联和预杂交后，与变性后的探针液K进行杂交反应；然后分别用洗液D和B清洗，再与抗体液L进行免疫反应；再经洗液A洗后，与显色液NBT/BCIP进行显色反应，最后检查并记录杂交膜上的显色结果。点样处出现蓝色斑点的相对应的鱼组织，则已被病毒感染。可早期方便地检测出病毒感染的精、卵、亲鱼、鱼苗及成鱼，以免造成重大损失。
文档编号G01N1/28GK1556410SQ20031011469
公开日2004年12月22日 申请日期2003年12月31日 优先权日2003年12月31日
发明者孙修勤, 李继业, 张进兴, 洪旭光, 吴谡琦, 曲凌云 申请人:国家海洋局第一海洋研究所