专利名称：食用菌和植物双链rna病毒检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种食用菌和植物双链RNA病毒检测试剂盒，属于病毒学、分子生物学领域。
背景技术：
1979年Morris和Dodds成功的将双链RNA(double-stranded RNA，简称dsRNA)技术用于植物和真菌病毒的研究中，双链RNA技术的基本方法是将去垢剂、抗氧化剂及螯合剂的缓冲液及有机溶剂加人充分破碎的植物组织中，使其变性去除蛋白质，并使双链RNA在适当乙醇浓度下与纤维素粉结合，再洗脱去除DNA及单链RNA，从而获得纯化双链RNA，纯化的双链RNA可通过电泳分析及其它手段鉴定其性质。大多数植物病毒在组织中复制时会产生双链RNA，而正常的植物中往往不产生，且双链RNA对酶具有一定的抗性，因而较易操作。不同病毒组中的病毒由于它们的基因组结构差异较大，因而在植物组织中产生的双链RNA具有特异性，而同一组内病毒产生的双链RNA具有一定的相似形，因此通过对植物组织中双链RNA的分析，可用于植物病毒的检测和诊断等研究中。近年来，双链RNA技术已日趋完善，由于从植物组织中提取双链RNA方法简单，不需要特殊设备，研究周期短，因而已被广泛应用于植物病毒研究中。食用菌中大部分病毒的基因组也属于双链RNA，因此，此方法也可运用于食用菌，如平菇，双孢蘑菇等。由于VLPs(virus-likeparticles，病毒样颗粒)不是总是存在的，有些双链RNA是裸露的，双链RNA技术更能快速、灵敏地检测出双链RNA病毒的存在。在国外，已经使用此方法成功地检测到平菇中的双链RNA基因组，即糙皮侧耳(平菇)病毒I，它的基因组有两个片段，双链RNA-1和dsRNA-2，长度分别为2296和2223bp。推测的氨基酸序列与两分体病毒科(Partitiviridae)相似，其中双链RNA-1编码RdRp，双链RNA-2编码衣壳蛋白。大约90％的植物病毒基因组为单链RNA，当病毒侵染植物后利用寄主成分进行复制时，首先产生与基因组RNA互补的链，配对成双链模板，再以互补链为模板转录出子代基因组RNA，互补链的长度与基因组RNA相同。这种双链RNA(double-stranded RNA，简称双链RNA)结构称为复制型分子(RF)，可在植物组织中积累起来。有些病毒基因组为双链RNA，因而复制后会产生大量的子代双链RNA基因组，而正常的植物中往往不产生。故此，双链RNA技术有很大的应用空间。该方法的另外一个优点是，可以利用琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的双链RNA做进一步的理论分析。我们可以利用RT-PCR反转录RNA进行测序，分析其基因的结构、功能以及其进化树；鉴定其所属的科、属、种；归类其相似性，探询其规律。同时，有助于我们从分子水平上了解双链RNA复制、进化的机制，为更好的脱毒做好准备。现在的食用菌和植物病毒的有电镜法、电泳法、血清学方法、酶联免疫吸附分析法、酶学法等方法，然而，电镜法的应用需要提取病毒颗粒，操作繁琐，且有些病毒是裸露的dsRNA，所以该方法虽然可靠，但不是一种简便的方法；血清学法，手续较多，在病毒浓度较低时，制备的抗血清效价不高，检测效果不理想，特异性不强，不适于ELISA或免疫电镜检测。酶联免疫吸附分析法虽然适用于无症状而有病毒的蘑菇、香菇、平菇等食用菌栽培菌株的检测，但需要抗体的制备，并连接在特定的酶上进行信号的放大，是以病毒颗粒和dsRNA的提取为基础的；酶法的检测是提取总的核苷酸，包括DNA、dsRNA、ssRNA，然用酶去除DNA和ssRNA，此方法在纯化dsRNA时，容易损失，且在RNase A酶切ssRNA和dsRNA时不容易控制，会出现样品被污染的情况。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便地检测食用菌和植物双链RNA病毒的试剂盒，并能应用于相关的病毒分子生物学研究方面。
为了达到上述目的，本发明的技术方案在于采用了一种食用菌和植物双链RNA病毒检测试剂盒，它包含有以下药物(1)提取缓冲液，由去垢剂、抗氧化剂及螯合剂组成的提取缓冲液，具有高盐、高pH值的物质，所述的提取缓冲液成分包括(a)GPS 0.2M甘氨酸、0.1M磷酸氢二钠、0.6M氯化钠，pH＝9.5；(b)STE 0.1M氯化钠、0.05M三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.001M乙二胺四乙酸(EDTA)pH＝8；(c)10％的十二烷基硫酸钠(SDS)；(d)β-巯基乙醇；(2)提取双链RNA的药物(a) 饱和酚/氯仿/异戊醇体系，其中氯仿/异戊醇的体积比为25/1(b) 乙酸钠3M(3)纯化的药物(a) 纤维素(b) 含15％的1×STE缓冲液(c)玻璃纤维；
(4)双链RNA的琼脂糖凝胶电泳检测药物(a)TAE 2M三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1M乙酸、0.1M乙二胺四乙酸 (EDTA)(b)2×SSC 0.3M氯化钠、0.03M柠檬酸钠(c)RNA酶A 100ug/ml(d)DNA酶I(RNase free)(e)分子marker(λ噬菌体DNA HindIII)(f)6×loading buffer(6×上样缓冲溶液)。
同时，本发明的技术方案还在于采用了一种食用菌和植物双链RNA病毒检测试剂盒的应用，包括常规样品的收集，双链RNA基因组提取、纯化，其中具体包括以下步骤(1)样品的收集用巴氏漏斗将培养好的菌丝收集，收集时用无菌超纯水洗涤3次，用滤纸吸去过多的水分，存放在4℃冰箱中，用时取出；或者采集植物组织、食用菌的子实体，装在密封袋中，存放在4℃冰箱中，用时取出；(2)所用的样品，怀疑存在病毒，或者有病变的症状；(3)提取缓冲液的配制所用的水为超纯水，STE配制为50×STE贮存液，用时稀释为不同倍数的STE工作液。菌丝提取时用GPS缓冲液，植物组织和子实体提取时用STE缓冲溶液；(4)提取双链RNA药物乙酸钠溶液配制用水为超纯水；(5)TAE配制为50×的贮存液；(6)RNA酶A配制为100mg/ml的贮存液；(7)DNA酶I(RNase free)反应体系10×DNase buffer，DNase酶I；
(8)双链RNA的提取(a)收集样品(b)加入提取缓冲溶液，每克样品加入1ml的GPS或者STE，0.1ml的10％的十二烷基硫酸钠(SDS)，0.1ml的β-巯基乙醇(c)每克样品中再加1ml的饱和酚，0.5ml的氯仿/异戊醇(25/1)，在研砵中研磨成匀浆，在冰上放置30min，偶尔轻轻的摇动形成乳浊液(d)离心(e)取上层淡黄色的水相，调整乙醇的浓度为15％(9)双链RNA的纯化(a)称取1.5g CF-11纤维素粉末，加入上e步骤中的溶液中，混合均匀(c)用专用的转移纤维素塑料的药匙转入一次性注射器中，注射器底部有玻璃纤维(d)用150ml含15％的1×STE缓冲液进行洗脱，弃洗脱液(e)再用10ml的1×STE缓冲液洗脱，收集洗脱液(f)加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的2M的乙酸钠(pH6.0)溶液，-20℃条件下过夜沉淀双链RNA(g)离心双链RNA，重悬浮于100ul双蒸水中(10)双链RNA的检测(a)酶切反应体系(a.1)DNA酶I(RNase free)反应体系(20ul)样品10ul10×DNase buffer2ul
DNase酶I 1ul超纯水7ul(a.2)RNA酶A反应体系(20ul)样品 10ulRNA酶A1ul2×SSC或者0.1×SSC9ul(b)用适量的苯酚(1～5ul)是酶失活而终止反应(c)琼脂糖凝胶电泳检测。
根据样品的不同，菌丝体用GPS，子实体和植物组织用STE，可选用的范围1～5×STE。
离心条件为在高速冷冻离心机8000r/min(4℃)，离心20min。
调整乙醇的浓度可为15～17％。
洗脱过程中测量洗脱液中的核苷酸的吸光值，波长为262nm，直至吸光值为零，3克的菌丝体大约为150ml。
离心dsRNA的条件为12000 r/min，20min，4℃。
RNA酶A在2×SSC反应溶液中，只降解ssRNA，而在0.1×SSC反应溶液中可以降解ssRNA(单链)和双链RNA，从而验证是否是双链RNA。
电泳检测可用0.8--1.5％的琼脂糖凝胶或者6％的聚丙烯酰胺。
用适量的苯酚(1～5ul)使酶失活而终止反应后可直接上样于琼脂糖凝胶或者聚丙烯酰胺凝胶电泳。
由于双链RNA对酶具有一定的抗性，因而较易操作。采用本发明的试剂盒不但能检测出病毒颗粒中的双链RNA，也可检测出裸露的双链RNA；本发明中可以利用琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的双链RNA做进一步的理论分析。采用本发明的试剂盒不需要特殊设备，研究周期短，简便、快速、灵敏，能在较少的样品中检测到病毒，不容易出现假阳性。本发明可以广泛的应用于食用菌和植物双链RNA病毒的检测，为脱毒菌种和脱毒苗的生产、制备，以及为防止病毒危害提供了有利手段。
本发明的dsRNA技术是很具有优势的，简便、快速、高效，方法简单，不需要特殊设备，研究周期短，以下的是此技术最大的优点(1)dsRNA对酶具有一定的抗性，因而较易操作。
(2)不但能检测出病毒颗粒中的dsRNA，也可检测出裸露的dsRNA。
(3)可以利用琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的dsRNA做进一步的理论分析。
图1为本发明的应用实施例1的电泳图；图2为本发明的应用实施例1的另一电泳图；图3为本发明的应用实施例2的电泳图。
具体实施例方式
制备食用菌和植物双链RNA病毒检测试剂盒实施例试剂盒中常规试剂除外，其它药物叙述如下本施例中的试剂盒是以3克菌丝为标准的，可用20次(1)提取缓冲液(a)60ml的GPS(b)300ml的20×STE
(c)6ml的10％的十二烷基硫酸钠(SDS)(d)6ml的β-巯基乙醇(2)提取双链RNA的药物(a)60ml饱和酚(b)3ml的氯仿/异戊醇(25/1)(3)纯化的药物及仪器(a)30克的纤维素(b)30克的玻璃纤维(c)20个一次性注射器(d)20个专用的转移纤维素塑料的药匙(e)3个洗脱时专用固定一次性注射器的支架(4)双链RNA的琼脂糖凝胶电泳检测药物(a)200ml的50×TAE(b)200ul的2×SSC(c)40ul的RNA酶A(d)20次的DNA酶I(RNase free)(e)1.5ml的分子marker(λ噬菌体DNA HindIII)(f)1.5ml的6×loading buffer将上述药物总装于试剂盒。
应用实施例1(1)菌丝的收集接种，上摇瓶培养7～9天，然后用纱布(四层)或布氏漏斗过滤，用无菌双蒸水洗涤3次，把获得的菌丝放在--20℃条件下冻存；
(2)菌丝得研磨取3.0g菌丝，加入提取缓冲液在研砵中充分研磨；提取缓冲液，GPS 1mL/g菌丝，等体积的饱和酚(1ml/g)，1/2体积的氯仿/异五醇(25/1，0.5ml/g)，1/10体积浓度为10％的SDS(0.1ml/g)，1/10体积的β-巯基乙醇(0.1ml/g)，研磨成匀浆后，在冰上放置30min，偶尔轻轻的摇动形成乳浊液；(3)离心研磨混合液用高速冷冻离心机在8000r/min(4℃)，离心20min，保留上层淡黄色的水相，加入无水乙醇使其最终的浓度为15％；(4)过柱称取1.5g CF-11纤维素粉末，加入以上混和液中，混匀后倒入10ml注射器内(下垫有剪碎的玻璃纤维)；用150ml含15％的1×STE缓冲液进行洗脱，弃去洗脱液，再用10ml的1×STE缓冲液洗脱，收集洗脱液，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的2M的乙酸钠(pH＝6.0)溶液，-20℃条件下过夜沉淀得双链RNA；(5)离心12000r/min，20min，4℃，收集沉淀(室温下干燥)，然后重悬浮于100ul双蒸水中；(6)电泳采用1％的琼脂糖凝胶电泳(恒压60V)，至溴酚蓝前沿接近胶板下边缘为止，然后用溴化乙锭溶液染色10-30min，拍照，观察双链RNA的带型。如图2所示，提取的平菇的dsRNA病毒，第一个泳道是以λ噬菌体DNAHindIII做的分子marker；第二、三个泳道是平菇dsRNA。图1中，第一泳道以λ噬菌体DNA HindIII做的分子marker；第二泳道为DNase I酶切平菇dsRNA；第三泳道是RNaseA在0.3M NaCl下酶切平菇dsRNA；第四泳道是RNaseA在15mM NaCl下酶切平菇dsRNA；第五个泳道是DNase I酶切marker。
应用实施例2(1)植物组织的采集采集怀疑与病毒有关的病变症状植物组织；(2)植物组织研磨取10克的植物组织放入研砵中，加入液氮，快速地充分研磨成粉末，加入提取缓冲液，GPS，1mL/g植物组织。等体积的饱和酚(1ml/g)，1/2体积的氯仿/异五醇(25/1，0.5ml/g)，1/10体积浓度为10％的SDS(0.1ml/g)，1/10体积的β-巯基乙醇(0.1ml/g)，在冰上放置30min，偶尔轻轻的摇动形成乳浊液；(3)离心研磨的混合液用高速冷冻离心机在8000r/min(4℃)，离心20min，保留上层淡黄色的水相，加入无水乙醇使其最终的浓度为15--17％；(4)过柱称取1.5g CF-11纤维素粉末，加入以上混和液中，混匀后倒入10ml注射器内(下垫有玻璃纤维)；用150ml含15-17％的1×STE缓冲液进行洗脱，弃去洗脱液，再用10ml的1×STE缓冲液洗脱，收集洗脱液，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的2M的乙酸钠(pH6.0)溶液，-20℃下过夜沉淀dsRNA；(5)离心12000r/min，20min，4℃，收集沉淀(室温下干燥)，然后重悬浮于100ul双蒸水中；(6)电泳采用1％的琼脂糖凝胶电泳(恒压60V)，至溴酚蓝前沿接近胶板下边缘为止。然后用溴化乙锭溶液染色10～30min，拍照，观察dsRNA的带型。
图3为平菇子实体中提取的dsRNA，第一泳道为第一个泳道是以λ噬菌体DNA HindIII做的分子marker；第二、三泳道为平菇子实体中的dsRNA。由于平菇的子实体与植物组织相似，所以此方法完全可以应用于植物dsRNA病毒的检测。
最后所应说明的是以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.食用菌和植物双链RNA病毒检测试剂盒，其特征在于，它包含有以下药物(1)提取缓冲液由去垢剂、抗氧化剂及螯合剂组成的提取缓冲液，具有高盐、高pH值的物质，所述的提取缓冲液成分包括(a)GPS 0.2M甘氨酸、0.1M磷酸氢二钠、0.6M氯化钠，pH＝9.5；(b)STE 0.1M氯化钠、0.05M三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.001M乙二胺四乙酸(EDTA)pH＝8；(c)10％的十二烷基硫酸钠(SDS)；(d)β-巯基乙醇；(2)提取双链RNA的药物(a)饱和酚/氯仿/异戊醇体系，其中氯仿/异戊醇的体积比为25/1(b)乙酸钠3M(3)纯化的药物(a)纤维素(b)含15％的1×STE缓冲液(c)玻璃纤维；(4)双链RNA的琼脂糖凝胶电泳检测药物(a)TAE 2M三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1M乙酸、0.1M乙二胺四乙酸(EDTA)(b)2×SSC 0.3M氯化钠、0.03M柠檬酸钠(c)RNA酶A 100ug/ml(d)DNA酶I(RNase free)(e)分子marker(λ噬菌体DNA HindIII)(f)6×loading buffer(6×上样缓冲溶液)。
2.一种如权利要求权所述的食用菌和植物双链RNA病毒检测试剂盒的应用，包括常规样品的收集，双链RNA基因组提取、纯化，其特征在于(1)样品的收集用巴氏漏斗将培养好的菌丝收集，收集时用无菌超纯水洗涤3次，用滤纸吸去过多的水分，存放在4℃冰箱中，用时取出；或者采集植物组织、食用菌的子实体，装在密封袋中，存放在4℃冰箱中，用时取出；(2)所用的样品，怀疑存在病毒，或者有病变的症状；(3)提取缓冲液的配制所用的水为超纯水，STE配制为50×STE贮存液，用时稀释为不同倍数的STE工作液。菌丝提取时用GPS缓冲液，植物组织和子实体提取时用STE缓冲溶液；(4)提取双链RNA药物乙酸钠溶液配制用水为超纯水；(5)TAE配制为50×的贮存液；(6)RNA酶A配制为100mg/ml的贮存液；(7)DNA酶I(RNase free)反应体系10×DNase buffer，DNase酶I；(8)双链RNA的提取(a)收集样品(b)加入提取缓冲溶液，每克样品加入1ml的GPS或者STE，0.1ml的10％的十二烷基硫酸钠(SDS)，0.1ml的β-巯基乙醇(c)每克样品中再加1ml的饱和酚，0.5ml的氯仿/异戊醇(25/1)，在研砵中研磨成匀浆，在冰上放置30min，偶尔轻轻的摇动形成乳浊液(d)离心(e)取上层淡黄色的水相，调整乙醇的浓度为15％(9)双链RNA的纯化(a)称取1.5g CF-11纤维素粉末，加入上e步骤中的溶液中，混合均匀(c)用专用的转移纤维素塑料的药匙转入一次性注射器中，注射器底部有玻璃纤维(d)用150ml含15％的1×STE缓冲液进行洗脱，弃洗脱液(e)再用10ml的1×STE缓冲液洗脱，收集洗脱液(f)加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的2M的乙酸钠(pH6.0)溶液，-20℃条件下过夜沉淀双链RNA(g)离心双链RNA，重悬浮于100ul双蒸水中(10)双链RNA的检测(a)酶切反应体系(a.1)DNA酶I(RNase free)反应体系(20ul)样品10ul10×DNase buffer2ulDNase酶I1ul超纯水 7ul(a.2)RNA酶A反应体系(20ul)样品10ulRNA酶A 1ul2×SSC或者0.1×SSC 9ul(b)用适量的苯酚(1～5ul)是酶失活而终止反应(c)琼脂糖凝胶电泳检测。
3.根据权利要求2所述食用菌和植物双链RNA病毒检测试剂盒的应用，其特征在于根据样品的不同，菌丝体用GPS，子实体和植物组织用STE，可选用的范围1～5×STE。
4.根据权利要求2所述食用菌和植物双链RNA病毒检测试剂盒的应用，其特征在于离心条件为在高速冷冻离心机8000r/min(4℃)，离心20min。
5.根据权利要求2所述食用菌和植物双链RNA病毒检测试剂盒的应用，其特征在于调整乙醇的浓度可为15～17％。
6.根据权利要求2所述食用菌和植物双链RNA病毒检测试剂盒的应用，其特征在于洗脱过程中测量洗脱液中的核苷酸的吸光值，波长为262nm，直至吸光值为零，3克的菌丝体大约为150ml。
7.根据权利要求2所述食用菌和植物双链RNA病毒检测试剂盒的应用，其特征在于离心dsRNA的条件为12000r/min，20min，4℃。
8.权利要求7所述食用菌和植物双链RNA病毒检测试剂盒的应用，其特征在于RNA酶A在2×SSC反应溶液中，只降解ssRNA，而在0.1×SSC反应溶液中可以降解ssRNA(单链)和双链RNA，从而验证是否是双链RNA。
9.根据权利要求2所述食用菌和植物双链RNA病毒检测试剂盒的应用，其特征在于电泳检测可用0.8-1.5％的琼脂糖凝胶或者6％的聚丙烯酰胺。
10.根据权利要求2所述食用菌和植物双链RNA病毒检测试剂盒的应用，其特征在于用适量的苯酚(1～5ul)使酶失活而终止反应后可直接上样于琼脂糖凝胶或者聚丙烯酰胺凝胶电泳。
全文摘要
本发明涉及一种食用菌和植物双链RNA病毒检测试剂盒及其应用，它包含有以下药物(1)提取缓冲液；(2)提取双链RNA的药物；(3)纯化的药物；(4)双链RNA的琼脂糖凝胶电泳检测药物。由于双链RNA对酶具有一定的抗性，因而较易操作。采用本发明的试剂盒不但能检测出病毒颗粒中的双链RNA，也可检测出裸露的双链RNA；本发明中可以利用琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的双链RNA做进一步的理论分析。采用本发明的试剂盒不需要特殊设备，研究周期短，简便、快速、灵敏，能在较少的样品中检测到病毒，不容易出现假阳性。本发明可以广泛的应用于食用菌和植物双链RNA病毒的检测，为脱毒菌种和脱毒苗的生产、制备，以及为防止病毒危害提供了有利手段。
文档编号G01N27/447GK101086011SQ20061001792
公开日2007年12月12日 申请日期2006年6月8日 优先权日2006年6月8日
发明者邱立友, 李彦鹏, 戚元成, 高玉千, 王淑敏, 梁振普, 申进文, 陈钢, 刘全军 申请人:河南农业大学