专利名称：：伊维菌素的单链抗体hsIVM8及其制备方法、其在免疫学检测的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗体，具体涉及一种伊维菌素的单链抗体hsIVM8及其制备方法、在免疫学检测的应用。
背景技术：
：伊维菌素(IVM)是大环内酯类广谱抗寄生虫药物，它通过与无脊柱动物神经细胞与肌肉细胞中谷氨酸为阀门的氯离子通道的高亲和力结合，从而导致细胞膜对氯离子通透性的增加，引起神经细胞或肌肉细胞超极化，使寄生虫麻痹或死亡。因其对多数线虫和节肢动物杀灭作用较强[l]，且不易使寄生虫产生耐药性，已被世界各国广泛用于水产业，农业，畜牧业及人类热带雨林病[2]等的治疗。然而不规范用药会引起伊维菌素在环境，食品和动物体内的高残留，作为高毒性化合物，对人和自然界产生了潜在危害[3-5]，使人类更加关注对IVM的检测，其中伊维菌素抗体在样品免疫检测中是关键。目前对伊维菌素残留检测的研究有液质、质谱[6，7]及依赖于单抗或多抗的ELISA法[8]。但是伊维菌素的单链抗体制备以及免疫分析法的建立，国内外均没有文献报道。参考文献[l]LYWen，XLYan，FHSun，etal.Arandomized,double-blind，multicenterclinicaltrialontheefficacyofivermectinagainstintestinalnematodeinfectionsinChina[J].ActaTropica.2008，106:190—194.[2]Z.Tadesse，A.Hailemariam，J.H.Kolaczinski.PotentialforintegratedcontrolofneglectedtropicaldiseasesinEthiopia[J].TransactionsoftheRoyalSocietyofTropicalMedicineandHygiene.2008，102:213—214.[3]B.A.Halley，T.A.Jacob,A.Y.H丄u，Theenvironmentalimpactoftheuseofivermectin-environmentaleffectsandfate，Chemosphere.18(1989)1543-1563.[4]D.R.Hennesy，M.R.Alvinerie，Pharmacokineticsofthemacrocycliclactones-Conventionalwisdomandnewparadigms,Macrocycliclactonesinantiparasitetherapy.NewYork:CABIPublishing;2002.97-124.[5]R.A.Wall，L.Strong,Environmentalconsequencesoftreatingcattlewiththeantiparasiticdrugivermectin,Nature.327(1987)418-421.[6]J.Raich-Montiu，K.A.Krogh，M.Granados，J.A.Jonsson，B.Hailing-S0rensen,Determinationofivermectinandtransformationproductsinenvironmentalwatersusinghoilowfibre—supportedliquidmembraneextractionandliquidchromatography-massspectrometry/massspectrometry，J.Chromatogr.A.1187(2008)275-280.[7]K.A.Krogh，E.Bjorklund，D.Loeffler，G.Fink，B.Hailing—S0rensen,3T.A.Ternes，Developmentofananalyticalmethodtodetermineivermectinsinwater,sedimentsandsoilsusingliquidchromatogr即hy—tandemmassspectrometry,J.Chromatogr.A.1211(2008)60-69.[8]D.J.Schmidt,C.E.Clarkson，T.A.Swanson，M.L.Egger，R.E.Carlson,J.M.VanEmon，A.E.Karu，Monoclonalantibodiesforimmunoassayofavermectins，J.Agric.FoodChem.38(1990)1763-1770.
发明内容发明目的目前伊维菌素残留检测方法依赖于昂贵的仪器，或是获得过程费时的多克隆抗体及实验环境要求苛刻的单克隆抗体。而廉价、快速、易于大批量获得的伊维菌素的单链抗体尚未见报道。本发明提供了一种廉价、简便、快捷的制备伊维菌素单链抗体的方法，并建立了依赖于单链抗体的适合大量样品快速筛查的伊维菌素免疫学检测方法。技术方案本发明的目的是这样实现的—种伊维菌素的单链抗体hsIVM8核酸序列为SeqNO.1。—种伊维菌素的单链抗体hsIVM8，其氨基酸序列为SeqNO.2。—种伊维菌素的单链抗体hsIVM8的制备，其特征在于以伊维菌素-牛血清白蛋白结合物为包被抗原包被免疫管，通过固相抗原筛选法从人源噬菌体抗体库TomlinsonJ中筛选展示伊维菌素单链抗体的噬菌体，用单克隆ELISA法筛选阳性噬菌体，将阳性噬菌体感染大肠杆菌HB2151进行可溶性抗体的表达，对单链抗体进行纯化，获得伊维菌素的单链抗体hsIVM8。—种单链抗体hsIVM8在伊维菌素间接竞争ELISA检测方法的应用，其特征在于如下步骤A、间接非竞争ELISA法测定单链抗体hsIVM8的工作浓度及效价选择0D值为1.0时的抗原抗体稀释浓度作为包被抗原、抗体工作浓度，以Ara45。/APJ!45。>2.1的最大稀释倍数作为抗体的最终效价；B、将伊维菌素标准品和待测样品与两倍工作浓度的单链抗体hsIVM8等体积混合过夜，所述的伊维菌素标准品的浓度为0.01，0.1，2，5，lOiig/mL;C、将工作浓度的伊维菌素包被抗原加入酶标板，洗去未吸附抗原，再加入封闭液封闭酶标板剩余的蛋白结合位点，洗去多余的封闭物；将所述的伊维菌素标准品与单链抗体hsIVM8的混合液和所述的待测样品与单链抗体hsIVM8的混合液分别加入酶标板，使伊维菌素包被抗原与混合液中的标准品或待测样品对单链抗体hsIVM8进行竞争免疫结合反应，在酶标板的微孔底部形成伊维菌素包被抗原-抗体复合物，洗去游离的抗原和抗体；然后加入辣根过氧化物酶HRP标记的anti-His抗体，使在酶标板上形成包被抗原_抗体_二抗-HRP复合物，洗去未结合的酶标二抗；再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色产物；最后加入50iiL/孔的2MH2S04，终止反应；D、用酶标仪测定不同浓度标准品孔及待测样品孔的吸光值，计算抑制率，绘制伊维菌素标准品浓度对抑制率的标准曲线，对线性范围进行回归分析，建立伊维菌素标准抑4制曲线的回归方程I=23.986LogC+35.267，R2=0.9294，伊维菌素对单链抗体hsIVM8的抑制中浓度IC5。为4.11g/mL，伊维菌素最低检测限IC1Q为0.088yg/mL，线性检测范围在0.1-5.OPg/mL，根据待测样品的吸光度计算待测样品的浓度；所述的I为伊维菌素对单链抗体hsIVM8的抑制率，C为伊维菌素浓度。所述的伊维菌素_牛血清白蛋白(IVM-BSA)的制备方法参照文献D.J.Schmidt,C.E.Clarkson，T.A.Swanson，M.L.Egger，R.E.Carlson,J.M.VanEmon，A.E.Karu，Monoclonalantibodiesforimmunoassayofavermectins，J.Agric.FoodChem.38(1990)1763-1770。所述的伊维菌素的单链抗体命名为hsIVM8。所述的HRP标记的anti-His抗体及大肠杆菌HB2151均购自北京GE公司，Pharmacia生产。本发明中所述的固相抗原筛选法具体为将4mL，100ug/mL牛血清白蛋白(BSA)和伊维菌素-牛血清白蛋白(IVM-BSA)分别包被免疫管，4t:过夜，次日用8mL含2X脱脂牛奶的PBS(PBSM)室温封闭2h，用含0.5%Tween-20的PBS(PBST)洗涤3次。加入1012pfu/mL的人源噬菌体抗体库TomlinsonJ于4mLPBSM中，与固相化抗原BSA室温反应lh后置于摇床中缓慢振荡lh。取出上清加入包被有IVM-BSA的免疫管中，室温反应lh后置于摇床中缓慢震荡lh。用500iiLTrypsin-PBS(50iiL的10mg/mLtrypsin溶液加入450iiLPBS)室温震荡洗脱10min。取250L洗脱的噬菌体感染1.75mL处于对数生长期的大肠杆菌TGl，37t:静置30min，取10yL铺板计算噬菌体滴度。按上述方法继续进行3次筛选，并计算每轮筛选的产出率(产出滴度/投入滴度)。1-4轮筛选包被的IVM-BSA浓度依次为100，75，50，20ug/mL。所述的大肠杆菌TGI购自北京GE公司，Pharmacia生产。所述的单克隆ELISA法筛选阳性噬菌体富集的重组噬菌体感染处于对数期的TGl，37t:静置30min，37t:摇床培养lh后涂布在含100yg/mL氨苄青霉素和1%葡萄糖的TYE(TYE-AG)固体培养基上，37。C培养过夜。随机挑选96个单菌落，分别接种于200uL2XTY-AG培养基中，37t:培养2h，加入25uL2XYT_AGM13K07(109pfu/mL)后继续培养lh，再1800g离心10min，倒掉上清，菌体沉淀用含100yg/mL氨苄青霉素和50yg/mL卡那霉素的2XTY(2XTY-AK)悬浮，3(TC培养过夜。次日，离心取上清单克隆ELISA鉴定每孔各取lOOuL加入到包被有IVM-BSA并已经用PBSM封闭2h的96孔板中室温反应lh，以包被载体蛋白BSA的孔作为阴性对照。PBST洗涤6次，加入1:5000HRP-羊抗M13抗体，37。C孵育lh，同上洗涤后，加HRP底物显色液显色15min，以2MH2S04终止反应，于波长450nm测定OD值，高于阴性值2.1倍的视为阳性。经ELISA鉴定的阳性值最高的克隆菌株表达的单链抗体为hsIVM8(图1)。所述的HRP标记的羊抗M13抗体购自北京GE公司，Pharmacia生产。所述的阳性噬菌体感染大肠杆菌HB2151进行可溶性抗体的表达取出20uL表达hsIVM8的过夜培养菌液加入到2mL2XTY-AG中，37。C摇床1.5h，3，300g离心10min，去上清后沉淀以2mL2XTY-AK重悬，37。C摇床培养过夜。3，300g离心10min后将上清加入含20%聚乙二醇6000和2.5MNaCl(PEG/NaCl)的溶液中，混匀后置冰上lh，3，300g离心30min尽可能的吸除管内的液体。以2XTY重悬重组噬菌体，加入lmL处于对数期的大肠杆菌HB2151，37t:水浴30min，铺TYE-AG平板，37。C过夜培养。挑过夜培养hsIVM8的单克隆菌落于3mL2XTY-AG中，37。C过夜培养。次日，取2mL到200mL含100ug/mL氨苄青霉素和0.1%葡萄糖的2XTY中，37。C摇床培养3h，加25mL含100ug/mL氨苄青霉素和9mM异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，25t:培养18h。单链抗体纯化经IPTG诱导表达的菌液于3，300g，4t:离心15min，弃上清，菌体沉淀加入10mL上样缓冲液(20mMTris-Cl;500mMNaCl;10mM咪唑；pH7.4)重悬后置于冰上用超声波细胞破碎仪破碎细胞，条件设为400W，工作5s，间隔8s，50次循环。12，000g，4°C离心10min取上清，过0.22iim膜过滤。镍亲和柱依次用双蒸水，上样缓冲液冲洗至平衡，过滤溶液上样，再分别用上样和洗涤缓冲液(20mMTris-Cl;500mMNaCl;20-60mM咪唑；pH7.4)洗涤至平衡。最后用洗脱缓冲液(20mMTris-Cl;500mMNaCl;500mM咪唑;pH7.4)洗脱目的蛋白。流速均控制在lmL/min。洗脱液立即用PBS透析过夜，换液3_4次。用12%SDS-PAGE胶检测其纯度(图2)。获得伊维菌素的单链抗体hsIVM8:ELISA鉴定的阳性值最高的克隆菌株表达的hsIVM8核酸序列送上海英俊公司测序，以确定其含有全长序列，hsIVM8的核酸序列为SeqNo.1;并利用PrimerPremier5.0推导氨基酸序列，以确定其能正确翻译成氨基酸，hsIVM8的氨基酸序列为SeqNo.2。本发明中所述的间接非竞争ELISA法测定抗体的工作浓度及效价，具体方法为用方阵滴定法确定抗体及包被抗原的工作浓度。选择OD值为1.0时的抗原、抗体稀释浓度作为抗原、抗体工作浓度。并用工作浓度的包被抗原包被96孔微孔板，将单链抗体hsIVM8进行倍比稀释，以PBS溶液作为空白对照，用间接非竞争ELISA法测定抗体效价，以Ara45。/A阴4s。>2.1的最大稀释倍数作为单链抗体hsIVM8的最终效价。建立单链抗体hsIVM8在伊维菌素间接竞争ELISA检测方法中的应用将O.Ol，0.1，2，5，10iig/mL伊维菌素标准品和待测样品分别与两倍工作浓度的单链抗体hsIVM8等体积混合过夜；工作浓度的伊维菌素包被抗原加入酶标板，洗去未吸附抗原，再加入封闭液封闭酶标板剩余的蛋白结合位点，洗去多余的封闭物；将所述的0.01，0.1，2，5，10iig/mL伊维菌素标准品和待测样品与单链抗体hsIVM8的混合液加入酶标板，使包被抗原与混合液中的标准品或待测样品对单链抗体hsIVM8进行竞争免疫结合反应，在酶标板的微孔底部形成包被抗原-抗体复合物，洗去游离的抗原和抗体；然后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的anti-His抗体，使在酶标板上形成包被抗原_抗体_二抗-HRP复合物，洗去未结合的酶标二抗；再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色产物；最后加入50iiL/孔的2MH2S04，终止反应；用酶标仪测定不同浓度标准品孔及待测样品孔的吸光值，计算抑制率，绘制伊维菌素标准品浓度对抑制率的标准曲线，对线性范围进行回归分析，建立伊维菌素标准抑制曲线的回归方程I=23.986LogC+35.267(R2=0.9294)，伊维菌素对单链抗体hsIVM的抑制中浓度(15。)为4.11i!g/mL，伊维菌素最低检测限I^为0.088iig/mL，线性检测范围在0.1_5.0yg/mL，根据待测样品的吸光度计算待测样品的浓度(图4)。有益效果1、本发明的优点在于国内外首次报道了伊维菌素的单链抗体hsIVM8制备与免疫学检测方法，与现有的抗体获得途径相比，该制备方法具有简单、快速、检测成本低等优点。2、本发明的抗体易于基因操作和基因工程大量生产，可用于构建多种双功能抗体分子，有助于标记和偶联其他分子。3、本发明的抗体含有(His)e标签蛋白，易于检测和纯化。4、本发明中伊维菌素对抗体的抑制中浓度(IC5。)为4.11i！g/mL，伊维菌素最低检测限IQ。为0.088iig/mL，抗体对伊维菌素的线性检测范围为0.1-5.0yg/mL，适用于环境及农产品中伊维菌素残留检测。图1筛选的11株阳性克隆的单克隆ELISA图2过镍亲和柱纯化后的SDS-PAGE电泳图图3间接竞争ELISA法建立的伊维菌素检测标准抑制曲线具体实施例方式下面结合附图对本发明作进一步的描述。固相筛选法对噬菌体的富集用固相抗原筛选法从人源抗体库中筛选伊维菌素的单链抗体hsIVM8:将4mL，100ug/mL牛血清白蛋白(BSA)和伊维菌素-牛血清白蛋白(IVM-BSA)分别包被免疫管，4t:过夜，次日用8mL含2X脱脂牛奶的PBS(PBSM)室温封闭2h，用含0.5%Tween-20的PBS(PBST)洗涤3次。加入1012pfu/mL的噬菌体抗体库于4mLPBSM中，与固相化抗原BSA室温反应lh后置于摇床中缓慢振荡lh。取出上清加入包被有IVM-BSA的免疫管中，室温反应lh后置于摇床中缓慢震荡lh。用500iiLTrypsin-PBS(50yL的10mg/mLtrypsin溶液加入450iiLPBS)室温震荡洗脱10min。取250yL洗脱的噬菌体感染1.75mL处于对数生长期的大肠杆菌TGl，37t:静置30min，取10yL铺板计算噬菌体滴度。按上述方法继续进行3次筛选，并计算每轮筛选的产出率。1-4轮筛选包被的IVM-BSA依次为100，75，50，20ug/mL。如表1所示，显示的是每轮富集后，特异性噬菌体在逐轮增加。为提高多样性，在首轮筛选是采用高浓度的包被原包被免疫管；为提高特异性，每轮包被原的量逐渐减少并增加洗涤强度。经过4轮筛选，产出/投入比趋于稳定。表1是固相筛选法对噬菌体的富集<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>阳性克隆的单克隆ELISA将富集的重组噬菌体感染处于对数期的TGl，37t:静置30min，37t:摇床培养lh后涂在含100g/mL氨苄青霉素和1%葡萄糖的TYE(TYE-AG)固体培养基上37。C培养过夜，随机挑选96个单菌落，分别接种于200uL2XTY-AG培养基中，37。C培养2h后，加入25uL2XYT-AG-M13K07(109pfu/mL)，37。C摇床250rpm培养lh，再1800g离心10min，倒掉上清，菌体沉淀用含100iig/mL氨苄青霉素和50iig/mL卡那霉素的2XTY(2XTY-AK)悬浮，3(TC培养过夜。次日，离心取上清单克隆ELISA鉴定每孔各取100uL加入到包被有IVM-BSA并已经用PBSM封闭2h的96孔板中室温反应lh，以包被载体蛋白BSA的孔作为阴性对照。PBST洗涤6次，加入1:5000HRP-羊抗M13抗体，37t:孵育lh，同上洗涤后，加HRP底物显色液显色15min，以2MH2S04终止反应，于波长450nm测定OD值。如图1所示，显示的是11个阳性克隆的单克隆ELISA值，将其中0D值最高的克隆展示的抗体命名为hsIVM8。hsIVM8的核酸序列测定将表达hsIVM8的单克隆菌液送上海英俊测序。序列显示，hsIVM8的核酸含有完整的重轻链可变区，序列完整，具体见SeqNO.1。hsIVM8的氨基酸序列推导利用PrimerPremier5.0推导hsIVM8氨基酸序列，序列显示，氨基酸序列含有特征性的(HiS)6标签及15个弹性短肽，具体见SeqNO.2。镍亲和柱纯化hsIVM8的SDS-PAGE电泳图挑过夜培养的表达hsIVM8的单克隆菌落于3mL2XTY-AG中，37"过夜培养。次日，取2mL到200mL含100ug/mL氨节青霉素和0.1%葡萄糖的2XTY中，37。C摇床培养3h，加25mL含100ug/mL氨苄青霉素和9mM异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，25。C培养18h。菌液于3，300g，4。C离心15min，弃上清，菌体沉淀加入10mL上样缓冲液(20mMTris-Cl;500mMNaCl;10mM咪唑；pH7.4)重悬后置于冰上用超声波细胞破碎仪破碎细胞，条件设为400W，工作5s，间隔8s，50次循环。12，OOOg，4。C离心10min取上清，过0.22ym膜过滤。镍亲和柱依次用双蒸水，上样缓冲液冲洗至平衡，过滤溶液上样，再分别用上样和洗涤缓冲液(20mMTris-Cl;500mMNaCl;20-60mM咪唑；pH7.4)洗涤至平衡。最后用洗脱缓冲液(20mMTris-Cl;500mMNaCl;500mM咪唑；pH7.4)洗脱目的蛋白。流速均控制在lmL/min。洗脱液立即用PBS透析过夜，换液3-4次。用12%SDS-PAGE胶检测其纯度。如图2所示，泳道1是蛋白Marker,2是纯化前菌液上清，3是经过镍亲和柱纯化，500慮咪唑洗脱下来的目标蛋白，纯度较高达95%以上。说明重组单链抗体hsIVM8已成功纯化。间接非竞争ELISA法测定抗体的工作浓度及效价(1)工作浓度的确定用方阵滴定法确定抗体及包被抗原的工作浓度。选择OD值为1.0时的抗原抗体稀释浓度作为包被抗原、抗体工作浓度，最终选择的包被抗原稀释倍数为1/1000(以蛋白计，包被抗原实际浓度为2iig/mL)，抗体的工作浓度为1/32。具体操作步骤如下①包被CBS包被缓冲液将包被原倍比稀释100X5n(n=0.5，1，2，4)，分别加于96孔酶标微孔板的AB、CD、EF、GH八行中，100iiL/孔，4。C过夜。②封闭每孔加3%BSA封闭液200iiL，37。C孵育lh。③加样将倍比稀释2n(n=8，16，32，64，128，256)的抗体分别加于酶标板的12、34、56、78、910、1112十二列孔中，100yL/孔，以PBS溶液为空白，25。C孵育2.5h。④加酶标二抗用含3%BSA的PBS溶液稀释酶标二抗到工作浓度，100yL/孔加入酶标板，25t:孵育1.5h。(以上每一步结束都用PBST洗涤液洗3次)⑤显色将底物溶液加到酶标板上，100iiL/孔，25t:显色15min。⑥终止反应将2MH2S(V决速加到96孔中，50iiL/孔，450nm读取光吸收值。用方阵滴定法确定的包被原工作浓度包被96孔酶标微孔板，将单链抗体hsIVM8进行倍比稀释，以PBS溶液作为空白对照，用间接非竞争ELISA法测定抗体效价，具体步骤按照以下步骤进行。以A^5。/A,5。〉2.l的最大稀释倍数作为抗体的最终效价。计算获得的抗体最终效价为1/256。具体操作步骤如下①包被将2iig/mL包被原加入96孔酶标微孔板中，100iiL/孔孔，4。C过夜。②封闭每孔加3%BSA封闭液200iiL，37。C孵育lh。③加样:将倍比稀释2n(n=4，8，16，32，64，128)的抗体分别加于酶标板的12、34、56、78、910、1112十二列孔中，100yL/孔，以PBS溶液为空白，25"C孵育2.5h。④加酶标二抗用含3%BSA的PBS溶液稀释酶标二抗到工作浓度，100yL/孔加入酶标板，25t:孵育1.5h。(以上每一步结束都用PBST洗涤液洗3次)⑤显色将底物溶液加到酶标板上，100iiL/孔，25t:显色15min。⑥终止反应将2MH2S(V决速加到96孔中，50iiL/孔，450nm读取光吸收值。间接竞争ELISA法建立伊维菌素的单链抗体免疫检测方法间接竞争ELISA(IC-ELISA)的建立，具体步骤如下(1)单链抗体hsIVM8与0.Ol，O.1，2，5，10iig/mL伊维菌素标准品和待测样品预混用PBS将抗体稀释16倍(两倍工作浓度)，再与等体积的伊维菌素标准品和待测样品室温预混进行前抑制，对照用PBS与抗体等体积预混，过夜。(2)包被将2ug/mL包被抗原加入酶标板，100iiL/孔，4。C过夜。(3)封闭每孔加3%BSA封闭液200ii1，37。C温浴lh。(4)加样品将预混液加入酶标板，100iiL/孔，以PBS为空白对照，25t:温浴2.5h。(5)加酶标二抗用含3%BSA的PBS将酶标二抗稀释到工作浓度加入酶标板，100iiL/孑L25t:温浴1.5h。(以上每一步结束都用洗涤液PBST洗3次)(6)显色将底物溶液加到酶标板上，100iiL/孔，25t:显色15min。(7)终止反应50iiL/孔2MH2S04快速加到96孔酶标板中，于450nm读取光吸收值。将0.01，0.1，2，5，10iig/mL伊维菌素标准品对应的吸光值(OD)，按照公式抑制率(工)=100[(0D对照-0D标样)/0D对照]，计算抑制率(I)。以抑制率为纵坐标，标样浓度(C)为横坐标绘制标准抑制曲线。建立伊维菌素的标准抑制曲线，并对线性范围进行回归9分析。最后计算得到，伊维菌素线性回归方程为I=23.986LogC+35.267(R2=0.9294)，伊维菌素对抗体的抑制中浓度(IC5。)为4.11g/mL，伊维菌素最低检测限IC1Q为0.088yg/mL，线性检测范围在O.1-5.0iig/mL，如图3所示。序列表SEQUENCELISTING〈110〉江苏省农业科学院〈120〉伊维菌素的单链抗体hsIVM8及其制备方法、其在免疫学检测的应用〈130>[1]LYWen，XLYan，FHS皿，etal.Arandomized,double-blind,multicenterclinicaltrialontheefficacyofivermectinagainstintestinalnematodeinfectionsinChina[J].ActaTropica.2008,106:190-194.〈160>2〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>798〈212>DNA〈213>人工序列〈400〉1gaggtgcagctcctgtgcagccagggaagggcagactccgctgcaaatgacatacgtttgtcaggcggagtcctccctgtattagcagcttatccggcatacagatttcacaacagcggggcggccgcacgatctgaatg〈210>2〈211>266〈212>PRT〈213>人工序列〈400>2GluValGinLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGlyGly15101510tgttggagtctggggg郷cttggtecagcctggggggtccctgagactc60cctctggattcacctttegcagctetgccatgagctgggtccgccaggct120ggctggagtgggtctcatcgatttgtcatgagggteagccgacatettec180tg皿gggraggttcaccatccacgctgtet2403C3gCCtg3g3gCCg3gg3Cacggccgtetattectgtgc300actectggggccaggg皿ccctggtcaccgtctcgagcggtgg郷cggt360gtggragcggcggtggcgggtcgacggacatccagatgacccagtctcca420ctgcatctgtgtcaccatcacttgccgggc皿gtcagagc■gtetc3gcag皿3CC3ggg3aagccccteagctcctgatc540cccctttgca皿gtggggtcccatcaaggttggatctggg600ctctcaccatcagcagtctgc皿cctg皿gattttgcaacttectectgt660cgagggcgcctecgacgttcggc咖gggacc皿ggtgga720atcatcatcaccatcacggggccgcag皿cctcag^gag780gggccgca798SetLeuArgLeuSetCysAlaAlaSetGlyPhe／hrPheSetSet／yr202530AlaMetSet／rioValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGlu／rioVal]SetSetIleCysHiSGluGlyLysPro／hr／yr／yrAlaAspSetVal505560LysGlyArgPhe／hrIleSetArgAspAShSetLysASh／hrLeu／yr65707580LeuGlnMetAShSetLeuArgAlaGluAsp／hrAlaVal／yr／yrCys859095AlaLysSetAspHiS／hrPheAsp／yr／rioGlyGlnGly／hrLeuVal100105110／hrValSetSetGlyGlyGlyGlySetGlyGlyGlyGlySetGlyGly]GlyGlySet／hrAspIleGlnMet／hrGlnSetProSetSetLeuSet130135140AlaSetValGlyAspArgVal／hrIle／hrCysArgAlaSetGlnSet145150155160IleSetSet／yrLeuASh／rio／yrGlnGlnLysProGlyLysAlaPro165170175LysLeuLeuIle／yrProAlaSetProLeuGlnSetGlyValProSet180185190ArgPheSetGlySetGlySetGly／hrAspPhe／hrLeu／hrIleSet]SetLeuGlnProGluAspPheAla／hr／yr／yrCysGlnGlnArgAla2lo215220ArgAlaPro／hr／hrPheGlyGlnGly／hrLysValGluIleLysArg225230235240AlaAlaAlaHiSHiSHiSHiSHiSHiSGlyAlaAlaGluGlnLysLeu245250255IleSetGluGluAspLeuAShGlyAlaAla26026权利要求一种伊维菌素的单链抗体hsIVM8，其核酸序列为SeqNO.1。2.—种伊维菌素的单链抗体hsIVM8，其氨基酸序列为SeqNO.2。3.—种伊维菌素的单链抗体hsIVM8的制备，其特征在于以伊维菌素-牛血清白蛋白结合物为包被抗原包被免疫管，通过固相抗原筛选法从人源噬菌体抗体库TomlinsonJ中筛选展示伊维菌素单链抗体的噬菌体，用单克隆ELISA法筛选阳性噬菌体，将阳性噬菌体感染大肠杆菌HB2151进行可溶性抗体的表达，对单链抗体进行纯化，获得伊维菌素的单链抗体hsIVM8。4.一种单链抗体hsIVM8在伊维菌素间接竞争ELISA检测方法的应用，其特征在于如下步骤A、间接非竞争ELISA法测定单链抗体hsIVM8的工作浓度及效价选择0D值为1.0时的抗原抗体稀释浓度作为包被抗原、抗体工作浓度，以Ara45。/APJ!45。>2.1的最大稀释倍数作为抗体的最终效价；B、将伊维菌素标准品和待测样品分别与两倍工作浓度的单链抗体hsIVM8等体积混合过夜，所述的伊维菌素标准品的浓度为0.01，0.l，2，5，10iig/mL;C、将工作浓度的伊维菌素包被抗原加入酶标板，洗去未吸附抗原，再加入封闭液封闭酶标板剩余的蛋白结合位点，洗去多余的封闭物；将所述的伊维菌素标准品与单链抗体hsIVM8的混合液和所述的待测样品与单链抗体hsIVM8的混合液分别加入酶标板，使伊维菌素包被抗原与混合液中的标准品或待测样品对单链抗体hsIVM8进行竞争免疫结合反应，在酶标板的微孔底部形成伊维菌素包被抗原_抗体复合物，洗去游离的抗原和抗体；然后加入辣根过氧化物酶HRP标记的anti-His抗体，使在酶标板上形成包被抗原_抗体_二抗-HRP复合物，洗去未结合的酶标二抗；再加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色产物；最后加入50iiL/孔的2MH2S04，终止反应；D、用酶标仪测定不同浓度标准品孔及待测样品孔的吸光值，计算抑制率，绘制伊维菌素标准品浓度对抑制率的标准曲线，对线性范围进行回归分析，建立伊维菌素标准抑制曲线的回归方程I=23.986LogC+35.267，R2=0.9294，伊维菌素对单链抗体hsIVM8的抑制中浓度IC5。为4.11iig/mL，伊维菌素最低检测限IC1Q为0.088yg/mL，线性检测范围在0.1-5.0i!g/mL，根据待测样品的吸光度计算待测样品的浓度；所述的I为伊维菌素对单链抗体hsIVM8的抑制率，C为伊维菌素浓度。全文摘要本发明涉及抗体，具体涉及一种伊维菌素的单链抗体hsIVM8及其制备方法、在免疫学检测的应用；本发明为以伊维菌素-牛血清白蛋白结合物为包被抗原包被免疫管，通过固相抗原筛选法从人源噬菌体抗体库TomlinsonJ中筛选展示伊维菌素单链抗体的噬菌体，用单克隆ELISA法筛选阳性噬菌体，将阳性噬菌体感染大肠杆菌HB2151进行可溶性抗体的表达，对单链抗体hsIVM8进行纯化，获得伊维菌素的单链抗体hsIVM8。本发明的优点在于国内外首次报道了伊维菌素的单链抗体hsIVM8制备与免疫学检测方法，与现有的获得抗体的途径相比，该制备方法具有简单、快速、成本低等优点。文档编号G01N33/53GK101717448SQ200910223819公开日2010年6月2日申请日期2009年11月23日优先权日2009年11月23日发明者刘媛,刘贤进,张晓,温爽申请人:江苏省农业科学院