专利名称：一种用于特异性检测新型h1n1流感病毒的合成多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于特异性检测新型Hmi流感病毒的合成多肽。
背景技术：
流行性感冒病毒简称流感病毒，是一类具有高度传染性的呼吸道病毒，也是被列 入生物恐怖武器的其中一种。目前检测新型Hmi流感病毒的方法主要有病毒分离培养、逆 转录多聚酶联反应(RT-PCR)、血清学诊断和抗原检测。但是，流感病毒分离鉴定所需的时间 长、成本高，且需要在生物安全实验室或国家指定研究机构进行，而RT-PCR则依赖于特定 的设备、良好的实验室条件和高素质的技术人员，难以在边境口岸推广应用，因此，亟待研 究建立一种新型Hmi流感病毒快速、有效的抗原诊断技术。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于特异性检测新型Hmi 流感病毒的合成多肽。为实现上述目的，本发明特异性合成多肽序列为CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。上述特异性合成多肽的筛选方法为(1)从NCBI数据库中检索、收集流感病毒HA亚型的氨基酸序列，利用DNA-STAR进 行序列比对和同源性分析比对，筛选出HA分子中信号肽之后到蛋白酶切位点之间具有良 好抗原性、亲水性和易溶性分析的330-350区段和500-520区段作为候选片段；(2)将筛选出的候选肽段与载体蛋白偶联，获得免疫抗体，通过特异性抗体的筛 选，最终得到对新型Hmi流感病毒具有特异性的合成多肽，该多肽的位点为322-340，其序 列为CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。进一步，所述载体蛋白为KLH血蓝蛋白。上述步骤⑵具体为以包被免疫家兔的偶联多肽检测免疫血清，当兔多抗血清滴度已经达到 1 100000，进行终放血，收获血清；利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作为包被抗原对免疫兔的多克隆血清抗体进 行筛选，其中，包被液称取Na2CO3O. 15g，NaHCO3O. 293g，蒸馏水稀释至 100ml，得到 0. 05mol/L PH9.6碳酸缓冲液，4°C，保存；洗涤液(稀释液)称取NaCl 8g, KH2PO4O. 2g, Na2HPO4. 12H20 2. 9g，量取 Tween-20， 0. 5ml，用蒸馏水加至 1000ml,即为 0. Olmol/L ρΗ7· 4PBS-Tween_20 洗涤液，4°C，保存；封闭液5%脱脂奶粉或BSA的pH7. 4PBS ；终止液2mol/L的硫酸溶液；然后按已知方式进行ELISA实验，并根据实验结果筛选出对新型Hmi流感病毒具 有特异性的合成多肽，即
1)包被抗原用包被液将病毒作1000倍稀释，反应板每孔加100ul，4°C冰箱保存 至少12h ；2)洗涤倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置2min，反复三次，最后将反应板倒置 在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；3)加封闭液 200ul，37°C放置 Ih ；4)洗涤同 2)；5)加抗体兔免疫血清用封闭液1 500倍稀释，反应板每孔加lOOul，同时作稀 释液对照，37 °C放置Ih;6)洗涤同 2)；7)加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG(l 1000倍稀释)，反应板每孔lOOul，37°C放置 lh;8)洗涤同 2)；9)加底物加TMBlOOml，室温暗处放置15min ；10)加终止液反应板每孔50ul ；11)观察结果用酶联免疫检测仪记录490nm读数。本发明特异性合成多肽具有抗原制备简单，不存在生物安全问题，且比天然微生 物或寄生虫蛋白抗原的特异性强，检测抗体的假阴性率和本底反应都很低等优点，综合流 感病毒的诊断方法情况，以及当前全球防控流感的严峻形势，本发明无疑具有较大的市场 价值和社会效益。
具体实施例方式下面结合实例对本发明进行详细说明。本发明特异性合成多肽的筛选方法包括如下步骤(1)肽抗原表位的生物信息学选择与合成、修饰从NCBI数据库中搜索流感病毒的HA氨基酸序列，用已知DNA-STAR和 antheprot5. 0分析显示，330-350之间部分无论在抗原性、亲水性还是易溶性分析都是很 好的候选片段；在400位下游存在大量的α螺旋结果，且主要位于疏水性片段，而且该区段 变异度很低，序列稳定，因此判断为可能的穿膜部分，该区域放弃。但该区域(500-520)之 后有较短的变异较大的区域，且该部分抗原性和亲水性均很强。同时，流感病毒的各亚型的 表位线性肽的序列如表1和表2所示。表 1 表2 故在330-350和500-520区域中，选择不同亚型的差异性片段合成十条备选多肽， 见表3。表 3 (2)抗体的制备以包被免疫家兔的偶联多肽检测免疫血清，当兔多抗血清滴度已经达到 1 100000，进行终放血，收获血清，各多肽的免疫血清抗体效价达到1 100000时的P/N 值见表4。
表 4 (3)合成多肽免疫血清中特异性抗体的筛选ELISA实验的建立利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作为包被抗原对免疫兔的多克隆血清抗体进 行筛选。1.实验材料与试剂HlNl、H3N2、新甲型Hmi流感病毒疫苗株来自长春生物制品所。酶标羊抗兔IgG抗体购自Sigma公司
96孔酶标板购自欣经科公司牛血清白蛋白(BSA)购自Roch公司Tween20 购自 Sigma 公司。包被液称取Na2CO3O. 15g, NaHCO3O. 293g,蒸馏水稀释至 100ml，即为 0. 05mol/L pH9. 6 (包被液)碳酸缓冲液，40C，保存；洗涤液(稀释液)称取NaCl 8g, KH2PO4O. 2g, Na2HPO4. 12H20 2. 9g，量取 Tween-20， 0. 5ml，用蒸馏水加至 1000ml,即为 0. Olmol/L ρΗ7· 4PBS-Tween_20 洗涤液(稀释液)，4°C，
保存；封闭液5%脱脂奶粉或BSA的pH7. 4PBS ；终止液2mol/L的硫酸溶液。2. ELISA 步骤
1)包被抗原用包被液将病毒作1000倍稀释，反应板每孔加lOOul，4°C冰箱保存 至少12h ；2)洗涤倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置2min，反复三次，最后将反应板倒置 在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；3)加封闭液 200ul，37°C放置 Ih ；4)洗涤同 2)；5)加抗体兔免疫血清用封闭液1 500倍稀释，反应板每孔lOOul，同时作稀释 液对照，37 °C放置lh；6)洗涤同 2)；7)加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG(l 1000倍稀释)，每孔lOOul，37°C放置Ih ；8)洗涤同 2)；9)加底物加TMBlOOml，室温暗处放置15min ；10)加终止液每孔50ul ；11)观察结果用酶联免疫检测仪记录490nm读数。3. ELISA实验结果见表5表5 结果判读若P/N> 2. 1时，则可以判定为阳性。从表5中可以看出，免疫血清 KLH-NH1N1-1与新型HlNl反应的P/N值为6. 09，与其它的血清的P/N值相比较，有很大的 差异。同时，血清KLH-NHim-I与病毒HlNl和H3N2的P/N值均小于2. 1，判为阴性。由此 说明，免疫血清KLH-NHmi-1可以特异性的与新型Hmi病毒反应。因此，由合成多肽X2与 KLH偶联后免疫得到的血清，可以用于特异性检测新型Hmi流感病毒。
权利要求
一种用于快速检测新型H1N1流感病毒的特异性合成多肽，其特征在于，所述特异性合成多肽的序列为CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。
2.—种权利要求1所述特异性合成多肽的筛选方法，其特征在于，具体如下(1)从NCBI数据库中检索、收集流感病毒HA亚型的氨基酸序列，利用已知DNA-STAR进 行序列比对和同源性分析比对，筛选出HA分子中信号肽之后到蛋白酶切位点之间具有良 好抗原性、亲水性和易溶性分析的330-350区段和500-520区段作为候选片段；(2)将筛选出的候选肽段与载体蛋白偶联，获得免疫抗体，通过特异性抗体的筛选，最 终得到对新型Hmi流感病毒具有特异性的合成多肽，该多肽的位点为322-340，其序列为 CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。
3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述载体蛋白为KLH血蓝蛋白。
4.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为以包被免疫家兔的偶联多肽检测免疫血清，当兔多抗血清滴度已经达到1 100000， 进行终放血，收获血清；利用全病毒(H3N2、H1N1、新型H1N1)作为包被抗原对免疫兔的多克隆血清抗体进行筛 选，其中，包被液称取 Na2CO3O. 15g, NaHCO3O. 293g，蒸馏水稀释至 100ml，得到 0. 05mol/L pH9. 6 碳酸缓冲液，4°C，保存；洗涤液(稀释液)称取 NaCl 8g，KH2PO4O. 2g，Na2HPO4. 12H20 2. 9g，量取 Tween-20， 0. 5ml，用蒸馏水加至 1000ml,即为 0. Olmol/L ρΗ7· 4PBS-Tween_20 洗涤液，4°C，保存；封闭液5%脱脂奶粉或BSA的pH7. 4PBS ；终止液2mol/L的硫酸溶液；然后按已知方式进行ELISA实验，并根据实验结果筛选出对新型Hmi流感病毒具有特 异性的合成多肽，即1)包被抗原用包被液将病毒作1000倍稀释，反应板每孔加100ul，4°C冰箱过夜(12h 以上)；2)洗涤倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置2min，反复三次，最后将反应板倒置在吸 水纸上，使孔中洗涤液流尽；3)加封闭液200ul，37°C放置Ih；4)洗涤同2)；5)加抗体兔免疫血清用封闭液1 500倍稀释，反应板每孔加lOOul，同时作稀释液 对照，37 °C放置lh；6)洗涤同2)；7)加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG(l 1000倍稀释)，反应板每孔lOOul，37°C放置Ih;8)洗涤同2)；9)加底物加TMBlOOml，室温暗处放置15min；10)加终止液反应板每孔50ul；11)观察结果用酶联免疫检测仪记录490nm读数。
全文摘要
本发明公开了一种用于快速检测新型H1N1流感病毒的特异性合成多肽，其序列为CKYVKSTKLRLATGLRNVPS。本发明特异性合成多肽具有抗原制备简单，不存在生物安全问题，且比天然微生物或寄生虫蛋白抗原的特异性强，检测抗体的假阴性率和本底反应都很低等优点，综合流感病毒的诊断方法情况，以及当前全球防控流感的严峻形势，本发明无疑具有较大的市场价值和社会效益。
文档编号G01N33/569GK101906151SQ20101023301
公开日2010年12月8日 申请日期2010年7月21日 优先权日2010年7月21日
发明者平芮巾, 张丽萍, 杨鹏飞, 王琳, 胡孔新, 郭雪, 马雪征 申请人:中国检验检疫科学研究院