专利名称：一种荧光定量PCR技术检测ERCC1 mRNA表达量的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用荧光定量PCR技术检测ERCCl mRNA 表达量的试剂盒。
背景技术：
自从1967年人们发现顺钼有抗癌活性以来，钼类金属抗癌药物的应用和研究得到了迅速发展。顺钼具有抗癌谱广、作用强等特点，为当前化疗中最常用的药物之一，钼类药物通过与细胞内DNA结合，导致DNA链间交链或链内交链，引起DNA损伤，从而导致细胞死亡。而顺钼等细胞毒性化疗药物对肿瘤损伤后，肿瘤细胞的DNA修复机制启动，具有较高修复能力的肿瘤细胞易于对化疗耐药。研究提示，DNA修复基因的表达状况可以作为化疗疗效相对理想的预测因子。核苷酸切除修复(NER)与钼类耐药关系密切，其中切除修复交叉互补基因I(ERCCl) 是参与该修复过程并导致钼类耐药的重要因子(van Duin Μ, de Wit J, Odijk H，et al. Molecular characterization of the human excision repair gene ERCC-1 :cDNA cloning and amino acid homology with the yeast DNA repair gene RADIO. Cell. 1986 ； 44(6) 913-923) 0近年来的研究发现ERCCl基因表达水平的高低与乳腺癌、肝癌、食管癌、胃癌、卵巢癌以及非小细胞肺癌的发病、生物学特性以及预后均有关(McDaniel LD, Schultz RA. XPF/ERCC4 and ERCCl their products and biological roles. Adv Exp Med Biol. 2008 ;637 :65-82)。ERCCl不同的表达与非小细胞肺癌治疗的选择、手术后药物的应用以及预后判断密切相关(Simon GR, Begum Μ, Bepler G. Setting the stage for tailored chemotherapy in the management of non-small cell lung cancer. Future Oncol. 2008Feb ；4(1) :51_59)。有文献报告，在早期非小细胞肺癌患者手术后ERCCl高表达者，其生存时间显著延长，预后好。可作为指导非小细胞肺癌预后的独立的预测指标；而在接受钼类药物化疗较晚期的非小细胞肺癌患者中，ERCCl阳性表达者反而较阴性表达者预后差，ERCCl阴性者无病生存期及总的生存期较ERCCl阳性者明显延长。体内和体外研究进一步证实ERCCl基因的表达水平同时与细胞对钼类药物的抵抗性呈正相关，ERCCl的高表达是导致肿瘤细胞对钼类药物耐药的最重要的机制之一(Martin L P，Hamilton TC, Schilder RJ. Platinum resistance :the role of DNA repair pathways. Clin Cancer Res. 2008 ； 14 (5) : 1291-1295)。ERCCl编码的273个氨基酸的蛋白质不具有核苷酸切除修复功能，所以在研究 ERCCl与化疗疗效关系时，应用免疫组化定量检测ERCCl蛋白含量不能反映ERCCl基因功能，而可采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR检测其mRNA水平。同时目前临床上常用的非小细胞肺癌的病理类型和临床分期等对于预测患者疗效和生存期并不理想，大量研究都希望能找到一些相关的非小细胞肺癌分子标记物，以期对患者的治疗和预后提供更有益的帮助。ERCCl基因表达就适应了这种要求，它不但对于非小细胞肺癌的预后估计有所帮助，而且对于手术后辅助化疗的药物选择更有指导意义。
目前尚无文献报告有关检测ERCCl mRNA表达量的试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能快速、简便、敏感、特异的检测ERCClmRNA表达量的
试剂盒。本发明的试剂盒利用荧光定量PCR技术，包含ERCCl基因引物、内参基因 (β -actin)引物和Taqman荧光探针ERCCl 基因上游引物序列为5' -GGGAATTTGGCGACGTAATTC-3‘ (SEQ ID NO 1)；ERCCl 基因下游引物序列为5' -GCGGAGGCTGAGGAACAG-3‘ (SEQ ID NO 2)；Taqman 荧光探针6FAM 5' -CACAGGTGCTCTGGCCCAGCACATA-3 ‘ TAMRA (SEQ ID NO: 3)；β-actin 基因上游引物序列为5' -TGAGCGCGGCTACAGCTT-3，(SEQ ID NO 4)；β-actin 基因下游引物序列为5' -TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3，(SEQ ID NO: 5)；Taqman 荧光探针6FAM 5，-ACCACCACGGCCGAGCGG-3，TAMRA (SEQ ID NO 6)。所述的试剂盒还包括进行荧光定量PCR所需的试剂。本发明的试剂盒具体包括第一链cDNA合成试剂、阴性对照和标准品、PCR反应液、RNA提取试剂等。其中的第一链cDNA合成试剂为25mmol/L MgCl2 4ul,10 X逆转录酶缓冲液2ul，IOmmol/L dNTP 2ul,RNA 酶抑制剂 0.5ul，Oligo (dT)15 0. 5ug,AMV 逆转录酶 15U，DEPC 7jC ；其中阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有ERCCl总RNA样品为阳性对照。其中的PCR反应液包括10XPCR Premix、0. 25pmol/ul的引物(ERCC1基因引物和内参基因引物)、0. 3pmol/ul的荧光探针、2. 5-4. OmM的Mgcl2、2U的Taq酶、0. 2-0. 4mM的 dNTPs、0. 2-1U 的 UNG 酶、0. 3-0. 6mM dUTP、通常取 l_2ul 的模板。用本发明的试剂盒检测ERCCl mRNA表达量首先获取临床癌组织样本，快速提取组织RNA，进行逆转录PCR合成第一链cDNA ；然后配置PCR反应液进行荧光定量PCR，在荧光定量PCR仪数据分析系统中读出CT值结果。分别计算ERCCl及β-actin基因的Ct值， 两者之差即为Δ Ct值。荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。本发明试剂盒的优点和效果如下(1)敏感荧光PCR检测技术是综合了 PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显象技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。(2)特异使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。(3)简便安全操作简单、安全、自动化程度高、防污染。扩增和检测可以在同一管 内检测，不需要开盖，不易污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，不再需要担心放射性污染。(4)快速速度快、高通量，可在3-4小时完成。
图IA为荧光实时定量RT-PCR检测ERCCl标准品的荧光曲线图。图IB为根据ERCCl标准品的荧光曲线图得到的标准曲线。图2A为荧光实时定量RT-PCR检测β -actin标准品的荧光曲线图。图2B为根据β -actin标准品的荧光曲线图得到的标准曲线。
具体实施例方式现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。实施例1.本发明试剂盒的制备(1)本发明试剂盒组成如下①Trizol 快速提取癌组织RNA ；②第一链cDNA合成试剂盒(RT-PCR)；③引物包括目的基因ERCC1、内参基因GAPDH及荧光探针，具体如下ERCCl基因引物序列上游5'-GGGAATTTGGCGACGTAATTC-3‘；下游5'-GCGGAGGCTGAGGAACAG-3‘；Taqman 荧光探针6FAM 5，-CACAGGTGCTCTGGCCCAGCACATA-3，TAMRAβ -actin基因引物序列上游5'-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3‘；下游5'-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3‘；Taqman 荧光探针6FAM5，-ACCACCACGGCCGAGCGG-3，TAMRA。上述引物序列、探针序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。④阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有ERCCl总RNA样品为阳性对照。⑤PCR 反应液10XPCR Premix,0. 25pmol/ul 的弓丨物、0. 3pmol/ul 的探针、 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、2U 的 Taq 酶、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 2-1U 的 UNG 酶、0. 3-0. 6mMdUTP.il 常取l_2ul的模板、反应总体积通常为20ul (以上所有的浓度都是指终浓度)⑥PCR扩增程序的设定在lightcyclerf.O仪器上通常是先50°C 10s,95°C lOmin，然后 95°C 15 秒 60°C lmin，循环 46 次。实施例2.用实施例1制备的试剂盒检测ERCCl mRNA的表达量以检测30例非小细胞肺癌石蜡切片标本组织结果为例。检测流程首先根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。获取临床癌组织样本，快速提取组织RNA，进行RT-PCR合成第一链cDNA ；配置PCR反应液进行荧光定量PCR。在 LightCycler数据分析系统中读出CT值结果。分别计算ERCCl及β -actin基因的Ct值， 两者之差即为Δ Ct值。荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。具体步骤如下①组织总RNA的抽提按RNA抽提纯化的方法抽提癌和癌旁组织总RNA。提取的 RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定^Onm与^Onm光密度值计算RNA的纯度与浓度，用0. 1% DEPC处理的水调节抽提的RNA至相同浓度。②反转录合成cDNA 取2ul上述RNA液在70°C保温IOmin随后加入25mmol/ L MgCl2 4ul，IOX 逆转录酶缓冲液 2ul，10mmol/L dNTP 2ul，RNA 酶抑制剂 0. 5ul， Oligo (dT)15 0. 5ug，AMV逆转录酶15U，补加DEPC处理水至总体积20ul，于42°C保温15min， 进行逆转录反应，合成cDNA第一链。反应结束后，加热至99°C 5min以灭活逆转录酶。加 20ul无菌水混勻置冰箱一 20°C保存。④荧光定量PCR扩增=PCR反应体系为20ul 含2Xpremix 10. Oul，ERCCl引物浓度0. 2ymol/L，探针浓度0. 3ymol/L，cDNAl. Oul，超纯水补齐。在Iightcycler荧光定量 PCR仪上反应扩增条件95°C IOmin预变性，95°C 15s,60°C Imin扩增40个循环，仪器自
动收集荧光信号。⑤数据收集处理和分析将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，得出目的基因相对于管家基因(β-actin)的相对表达量后再进行统计分析，以比值大于0.5为高表达
权利要求
1. 一种利用荧光定量PCR技术检测ERCCl mRNA表达量的试剂盒，包含ERCCl基因引物、内参基因β -actin引物和Taqman荧光探针ERCCl 基因上游引物序列为5' -GGGAATTTGGCGACGTAATTC-3‘； ERCC1 基因下游引物序列为5 ‘ -GCGGAGGCTGAGGAACAG-3 ‘； Taqman 荧光探针6FAM 5，-CACAGGTGCTCTGGCCCAGCACATA-3，TAMRA ； β-actin 基因上游引物序列为5' -TGAGCGCGGCTACAGCTT-3，； β-actin 基因下游引物序列为5' -TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3，； Taqman 荧光探针6FAM 5，-ACCACCACGGCCGAGCGG-3，TAMRA。
2.根据权利要求1所述的一种利用荧光定量PCR技术检测ERCClmRNA表达量的试剂盒，其特征在于该试剂盒具体包括第一链cDNA合成试剂、阴性对照和阳性对照、PCR反应液和RNA提取试剂；其中的第一链cDNA合成试剂为25mmol/L MgCl2 4ul,IOX逆转录酶缓冲液2ul，10mmol/L dNTP 2ul,RNA酶抑制剂0. 5ul，Oligo (dT) 15 0. 5ug,AMV逆转录酶15U，DEPC 水；其中阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有ERCCl总RNA样品为阳性对照；其中的PCR反应液包括10XPCR Premix、0. 25pmol/ul的ERCCl基因引物和内参基因引物、0. 3pmol/ul 的荧光探针、2. 5-4. OmM 的 Mgcl2、2U 的 Taq 酶、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、 0. 2-1U 的 UNG 酶、0. 3-0. 6mM dUTP、通常取 l_2ul 的模板。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域。一种快速检测ERCC1 mRNA的荧光定量PCR诊断试剂盒，目的在于提供一种能快速、简便、敏感、特异的检测ERCC1 mRNA的试剂盒及其应用，DNA修复基因的表达状况可能作为化疗疗效相对理想的预测因子。核苷酸切除修复(NER)与铂类耐药关系密切，其中切除修复交叉互补基因1(ERCC1)是参与该修复过程并导致铂类耐药的重要因子，采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR检测ERCC1 mRNA水平，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高，该试剂盒为临床恶性肿瘤患者是否使用铂类化疗药物提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。
文档编号G01N21/64GK102154475SQ20111003231
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月28日 优先权日2011年1月28日
发明者刘亚莉, 刘辉, 周伟平, 张敬磊 申请人:中国人民解放军第二军医大学