专利名称：磷光二氧化硅纳米颗粒标记的定量检测西马特罗的免疫层析试纸条及制备方法
技术领域：
本发明涉及ー种免疫层析试纸，特别是涉及一种用磷光二氧化硅纳米颗粒为标记的用于定量检测西马特罗的免疫层析试纸条及制备方法。
背景技术：
西马特罗(cimaterol, CIM)又名喜马特罗,塞曼特罗,属于苯こ胺类药物的ー种，是ー种强效β 2-受体激动剂。CM在医学和兽医临床上主要用于扩张气管和増加肺通气量，可以用于哮喘、阻塞性肺炎、平滑肌痉挛和休克等症。研究显示，饲喂CIM可以增加肥育猪的饲料报酬并增加瘦肉率，对牛、鸡、鸭和绵羊等动物都有一定作用，故CIM常被作为饲料添加剂非法用于动物源性食品生产中。长期使用则可能造成CIM在可食动物组织内蓄积性残留，常常引起食用者发生心悸、肌肉震颤、疼痛、神经症状、头晕头痛、恶心呕吐、发热寒战等临床症状，特别对心脏病、糖尿病和高血压等病人危害更大。鉴于CIM的明显危害，我 国禁止CM在畜禽生产中应用，并规定在所有的动物可食组织中不得检出。目前，用于西马特罗残留检测的方法较多，如(I)理化分析方法，如高压液相色谱法、气相色谱法、薄层层析法、电泳法等；(2)免疫分析法，如放射免疫法、酶联免疫吸附法等；(3)生物測定法，如微生物学測定法、放射受体测定法等。这些方法需要昂贵的仪器设备，需要熟练的专业人员操作，过程复杂，时间较长，限制了其应用范围，难以在生产中推广应用。免疫分析标记技术是指以抗原抗体间的特异性反应为基础，通过标记物对某种物质进行定性或定量检测的研究。标记免疫分析一般是将酶、荧光素、放射性核素等标记物对抗体或抗原进行标记，这种标记物保持了抗体或抗原的活性，不影响标记物的活性，当它与相应抗体或抗原反应后，可以直接测定复合物中的标记物，直接对目标物质进行定量分析。通过标记物的信号放大作用，可以提高免疫分析的敏感性。荧光免疫分析是以荧光素、荧光染料、量子点、镧系元素等为标记物，将抗原或抗体标记以突光物质与相应的抗原或抗体结合,在突光显微镜下检测突光强度的一种检测方法。该法具有灵敏度高、特异性强的特点，但某些荧光素会产生生物学毒性，导致抗原或抗体的灵敏度和选择性下降。
发明内容
本发明要解决的技术问题提供一种用磷光二氧化硅纳米颗粒为标记的检测西马特罗免疫层析试纸条及其制备方法，该试纸条具有特异、灵敏、快速、简便定量检测微量西马特罗的特点。本发明的技术方案
ー种磷光二氧化硅纳米颗粒标记的检测西马特罗的免疫层析试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、磷光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有用偶联西马特罗的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述磷光抗体纤维层采用吸附磷光抗体的玻璃纤维棉制成，磷光抗体采用磷光二氧化娃纳米颗粒标记的西马特罗抗体。所述磷光二氧化硅纳米颗粒的粒径为100_220nm。所述磷光二氧化硅纳米颗粒标记的西马特罗抗体由以下方法制备，具体步骤为 (O磷光二氧化硅纳米颗粒的氨基化将Ig磷光二氧化硅纳米颗粒分散在甲苯溶
液中，加入O. 3-lmL 3-氨丙基三こ氧基硅烷，回流12-24h ;回流液冷却后6500rpm离心5-10min，将得到的沉淀用无水こ醇洗涤，再将沉淀分散在无水こ醇中；
(2)西马特罗抗体的标记将西马特罗抗体置于2-8°C、浓度O. 025-0. 05mol/L、pH9. 5的CBS缓冲液中透析8_12h ;将氨基化的磷光二氧化硅纳米颗粒10000-13000rpm离心4_8min,用所述CBS缓冲液洗漆，然后与透析的西马特罗抗体混合均匀，于2-8°C反应，过夜，得到磷光二氧化硅的抗体复合物；向所得的抗体复合物中按I :50-120的体积比加入O. 5mol/L的氰基硼氢化钠溶液，混匀，2_8°C反应8_12h ;用质量浓度2%的BSA溶液封闭过夜，10000-13000rpm离心4_8min，得沉淀；将沉淀用O. 5mL、浓度
O.01-0. 02mol/L、pH7. 8 的 Tris-HCL 缓冲液洗涤后，4°C保存，备用。所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏ニ氟こ烯膜或聚酯膜；吸水材料层用吸水滤纸，支撑层用不吸水的韧性材料；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜； 偶联西马特罗的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。所述隐形检测印迹和隐形对照印迹为平行排列的“ Il ”直线式印迹，或“十十”字型排列印迹，或“丁丁”字型排列印迹，或“丄I”字型排列印迹，或“トト”字型排列印迹，或N ”字型排列印迹。所述保护层为吸附纤维层、磷光抗体纤维层及吸水材料层上覆盖的保护膜；在吸附纤维层与磷光抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该样品标记线偏向吸附纤维层ー侧O. 3-0. 7cm。所述磷光二氧化硅纳米颗粒采用以下方法制备
按O. 75-1. 5 2 3的体积比量取浓氨水、こ醇、水，置于反应器中混合，搅拌均匀，得到反应液A ;将正硅酸四こ酷、こ醇按1-2. 5 22的体积比混合，搅拌均匀得到溶液B ;将溶液B迅速加入到反应液A中，室温反应2h ；6500rpm离心5min,得沉淀；将沉淀用こ醇超声波洗涤，80°C烘干，于400-800°C下煅烧2-4h，即得到磷光二氧化硅纳米颗粒。所述免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤
(1)西马特罗单克隆抗体或多克隆抗体的制备；
(2)磷光抗体纤维层的制备包括磷光二氧化硅纳米颗粒的氨基化、西马特罗抗体的标记和纤维层的制备；
(3)吸附纤维层的制备吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏ニ氟こ烯膜或聚酯膜制成； (4)纤维素膜层的制备纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜，用点样仪在纤维素膜上不同位置分别喷点检测印迹和对照印迹，烘干后备用；(5)试纸条的组装将吸附纤维层、磷光抗体纤维层、纤维素膜层、吸水材料层从右至左依次贴在带有粘合剂的支撑层上，依次将支撑层、吸附层和保护层组装成试纸条。所述磷光抗体纤维层制备的具体方法如下
(O磷光二氧化硅纳米颗粒的氨基化将Ig磷光二氧化硅纳米颗粒分散在甲苯溶液中，加入O. 3-lmL 3-氨丙基三こ氧基硅烷，回流12-24h ;将回流液冷却后6500rpm离心5-10min，得到的沉淀用无水こ醇洗涤，再将沉淀分散在无水こ醇中；
(2)西马特罗抗体的标记将西马特罗抗体置于2-8°C、浓度O.025-0. 05
mol/L、pH9. 5的CBS缓冲液中透析8_12h ;将氨基化的磷光二氧化硅纳米颗粒10000-13000rpm离心4_8min,用所述CBS缓冲液洗漆,然后与透析的西马特罗抗体混合均匀，于2-8°C反应，过夜，得到磷光二氧化硅的抗体复合物；向抗体复合物中按I :50-120的体积比加入O. 5mol/L的氰基硼氢化钠溶液，混匀，2-8°C反应8_12h ;用质量浓度2% 的BSA溶液封闭过夜，10000-13000rpm离心4-8min，得沉淀；将沉淀用O. 5mL、浓度O. 01-0. 02mol/L、pH7. 8的Tris-HCL缓冲液洗涤后，4°C保存；
(3)磷光抗体纤维层的制备将制备的磷光二氧化硅抗体复合物用含有2%酪蛋白的Tris缓冲液稀释100-1000倍，然后将作为标记物垫的玻璃纤维棉浸入其中，以浸湿为准，冻干，备用；所述Tris缓冲液的浓度为10 mM，pH值为7.8。本发明的试纸条具有以下优点
(I)特异性强，灵敏度高。本发明试纸条将高灵敏的磷光二氧化硅纳米颗粒与免疫层析技术相结合，磷光二氧化硅纳米颗粒无需包裹任何荧光材料便可自行发光，且磷光寿命长，制作成本低、光稳定性強，能获得比普通磷光检测更高的灵敏度。该试纸条既保持了传统胶体金试纸条简便快速的优点，又克服了后者灵敏度低、无法定量的缺点，检测灵敏度更高、更稳定，最低可检测到匹克级的痕量残留。(2)简便、快速。该试纸条可对全血、尿液、唾液、组织匀浆等直接检测，无须进行样品的预处理，在紫外光下直接观测结果，也可借助荧光阅读器直接读值，实现定量检测。检测时只需将试纸条插入被检样品10 20秒，5分钟内即可判定检测结果，可现场操作，省时省力，操作简便，一歩完成。(3)结果显示形象、直观、准确。试纸条以显示蓝白色“ I ”和“ Il ”(或“十”、“丁”、“丄”、“ト”、“_| ”)印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条蓝白色“丨”印迹，表示被检样品中含有CIM;显示两条蓝白色“ Il ”印迹，表示被检样品中不含CIM。检测结果可用肉眼直接观察，结果形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。(4)节省费用。该试纸条检测时无需另配仪器设备和其它试剂，可随时随地进行检測，既能定性检测又能定量检测；检测费用低廉，能节省大量贵重仪器和设备的投入费用。(5)适用范围广，便于推广应用。该试纸条能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、畜产品加工、养殖户以及消费者个人等，既适于单个样品的检测，又适于大量样品的筛查，能应用于疾病诊断、毒品检测、细菌检测和环境检测等领域。本发明在保障食品安全、保护消费者健康方面具有极其重要意义，具有明显的经济效益和社会效益。(6)本发明制备磷光二氧化硅纳米颗粒的エ艺简单可行，易于操作。以磷光二氧化硅纳米颗粒标记CIM抗体时，只需将氨基化的磷光二氧化硅纳米颗粒与抗体直接偶联，方法易行可控，通过调节磷光二氧化硅与抗体的摩尔比控制偶联率，从而有效提高基于磷光ニ氧化硅纳米颗粒标记的侧流层析免疫试纸条的灵敏度。
图I为本 发明中磷光二氧化硅纳米颗粒的TEM表征 从图I可知，磷光二氧化硅纳米颗粒的形态均一、大小一致，呈单分散状，有利于标记抗体，为其作为探针用于侧流层析免疫试纸奠定基础。图中颗粒粒径为200±5nm。图2为本发明的免疫层析试纸条的结构示意 图3为本发明的免疫层析试纸条的俯视图结构示意 图4为本发明的免疫层析试纸条对CIM的回归曲线图。
具体实施例方式本发明试纸条的制备过程包括西马特罗单克隆或多克隆抗体的制备、磷光抗体纤维层的制备、吸附纤维层的制备、纤维素膜层的制备和试纸条的组装等步骤。( I)抗西马特罗单克隆抗体或多克隆抗体的制备
单抗制备以50Pg IOOPg/只的西马特罗载体蛋白偶联物免疫6 8周龄Balb/C小鼠3 4次，毎次免疫间隔时间3 5周，确定抗体效价符合要求后超强免疫，之后3 4天，将免疫小鼠眶下窦采血，分离阳性血清；脱颈致死，用75%的酒精浸泡小鼠5 IOmin消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，IOOOrpm离心lOmin，收集脾细胞。将IX IO8的脾细胞与NSO骨髓瘤细胞按10:1的比例混合，IOOOrpm离心lOmin，弃上清，细胞沉淀物于37°C水浴中缓缓加入O. 7 I. O mL CIM的50%PEG4000，作用lmin，然后缓缓加入无血清1640培养基15 mL,以终止PEG的作用，37°C水浴5 10 min，IOOOrpm离心lOmin，弃上清，将细胞沉淀物重悬于HAT选择培养基中，并加入96孔细胞培养板孔(ΙΟΟμ 200μ 7孔)，置于37°C、5%C02培养箱中培养10 14天，用间接ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行3次有限稀释克隆化，而后扩大培养，建立杂交瘤细胞株。所制备的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体可特异地与西马特罗反应，亲和力常数达到101° 1012，轻链亚型为K或λ，重链亚型为IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3,针对西马特罗特异抗原决定簇的单克隆抗体，用于磷光二氧化硅纳米颗粒的标记。多抗制备用西马特罗载体蛋白偶联物免疫新西兰白兔，免疫剂量为20(^g 500μ8/次，背部皮下分4 6点注射。首免，用无菌PBS溶解西马特罗载体蛋白偶联物，与等量FCA混合，充分乳化；加强免疫，用无菌PBS溶解西马特罗载体蛋白偶联物，与等量FIA混合，充分乳化，首免后2 3周进行连续免疫4 5次，每次间隔2 3周，最后一次免疫后10 15天，以ELISA法测其定效价达到IO5以上吋，采血并分离收集高免血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，即取I份高免血清加2份PBS (ρΗ7. 2)混匀，加等体积饱和硫酸铵溶液混匀，置4°C冰箱12h，4°C、2500rpm离心15min，弃上清；再以适量PBS (pH7. 2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度33%，置4°C冰箱2h，4°C、2500rpm离心15min，弃上清；以适量PBS (pH7. 2)溶解沉淀，置4°C冰箱内用PBS (pH7. 2)透析48 72h，中间换液数次，4°C、12000rpm离心15min,收集上清,得纯化的抗西马特罗多克隆抗体，_20°C冻存,用于磷光二氧化硅纳米颗粒的标记。(2)磷光抗体纤维层的制备
a.磷光二氧化硅纳米颗粒的制备
采用反相微乳法制备空白ニ氧化硅纳米颗粒，通过优化微乳液中各组分的配比和氨水的量来控制纳米颗粒的大小。干燥后的ニ氧化硅纳米颗粒放于马弗炉中高温煅烧，根据不同煅烧温度，得到不同磷光强度和顔色的磷光二氧化硅纳米颗粒。具体过程如下
将浓氨水(质量含量28%)、こ醇、水按1 2 3的体积比置于烧杯中，均匀搅拌，得到反应液A ;将正硅酸四こ酷、こ醇按1:11的体积比混合均匀，得到B溶液；将B溶液迅速加入到反应液A中，室温反应2h ;6500rpm离心5min,得沉淀,将沉淀用こ醇超声波洗漆3遍，80°C烘干，于600°C下煅烧2h，即得到磷光二氧化硅纳米颗粒。參见图I。b.抗西马特罗单克隆抗体的标记
第一歩，磷光二氧化硅纳米颗粒的氨基化将Ig磷光二氧化硅纳米颗粒分散在甲苯溶液中，加入O. 3-lmL APTES (3-氨丙基三こ氧基硅烷)，回流12_24h ;回流液冷却后6500rpm离心5-10min，将沉淀用无水こ醇洗漆，最后分散在无水こ醇中；
第二步，西马特罗抗体的标记将西马特罗抗体置于2-8°C、浓度O. 025-0. 05mol/L、pH9. 5的CBS缓冲液中透析8-12h ;将ニ氧化硅颗粒10000-13000rpm离心4_8min，用CBS缓冲溶液洗涤，然后与透析的西马特罗抗体混合均匀，在2-8°C反应，过夜，得到磷光二氧化硅的抗体复合物；向抗体复合物中按抗体复合物与氰基硼氢化钠溶液I :50-120的体积比加入O. 5mol/L的氰基硼氢化钠溶液，混匀，2-8°C反应8_12h ;用质量浓度2%的BSA溶液封闭过夜，10000-13000rpm离心4_8min得沉淀；将沉淀用O. 5mL的Tris-HCL缓冲液(O. 01-0. 02mol/L, ρΗ7· 8)洗涤，4°C保存，备用。c.磷光抗体纤维层的制备
将制备好的磷光二氧化硅-抗体复合物用含有2%酪蛋白的10 mM Tris pH 7. 8缓冲液稀释100-1000倍，然后将作为标记物垫的玻璃纤维浸入其中，以浸湿为准，然后冻干，备用。或将稀释后的磷光二氧化硅-抗体复合物在检测前以O. 5-1. 5 μ L的量滴加到磷光抗体纤维层中。(3)吸附纤维层的制备
测试端吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏ニ氟こ烯PVDF膜或聚酯膜制备，将纤维材料剪成宽I. 5cm的条带，将其放入样品垫封闭液中浸泡30min，于37°C烘干，备用。
(4)纤维素膜层的制备
纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜，剪切成宽I. 5cm规格的条带，用点样仪在纤维素膜上不同位置分别喷点CIM抗原和羊抗小鼠IgG抗体(或兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG抗体)，制作隐形的检测印迹带和对照印迹带，于37°C烘干备用。(5)羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体的制备
以饱和硫酸铵提取西马特罗阴性小鼠血清IgG(或阴性兔血清IgG)，即取I份小鼠血清(或兔血清)加2份PBS (pH7. 2)混匀，加等体积饱和硫酸铵溶液混匀，置4°C冰箱12h，4°C、2500rpm离心15min，弃上清，再以适量PBS (pH7. 2)溶解沉淀，加饱和硫酸铵溶液至终浓度33%，置4で冰箱211，4で、2500印111离心15min，弃上清，以适量PBS(pH7. 2)溶解沉淀，置4°C冰箱内用PBS (ρΗ7· 2)透析48h，中间换液3次，4°C、12000rpm离心15min，收集上清，以紫外分光光度计测定其蛋白浓度，以5(^g lOOPg/kg体重的小鼠血清(或兔血清)IgG经皮下和肌肉注射健康山羊或家兔3 4次，末次注射10天后，以ELISA測定其血清效价达到I :2000以上时，心脏或动脉采血，分离收集高免血清，以饱和硫酸铵提取羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗体(方法与提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于西马特罗检测试纸条对照印迹的制备。(6)本发明试纸条的检测反应原理
当检测cna式纸测试端插入待测样品溶液后，待测溶液通过虹吸作用带动待测CM及磷光抗体玻璃纤维棉中的磷光抗体一起向纤维素膜层扩散，并最终渗入手柄端的吸水材料层。在扩散过程中，待测CIM可与磷光抗体相结合，进而封闭磷光抗体上CIM的抗原结合点，阻止磷光抗体与纤维素膜上的人工抗原的检测印迹结合不能显示检测印迹，而羊或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体则可与磷光抗体结合，在紫外线激发下(或使用荧光阅读器直接读值)形成蓝白色对照印迹带“ I ”，即一条蓝白色帯“ I ”印迹为阳性表示；反之样品溶液中无CM吋，则不能阻止磷光抗体与纤维素膜上的CM人工抗原检测印迹结合，显示蓝白色检测印迹带“ I ”，同样羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗体也与金标抗体结合，显示蓝白色对照印迹带“ I ”，形成两条蓝白色帯“ Il ”为阴性表示。如果纤维素膜上没有任何蓝白色带显示，则表明试纸条已失效。以下实施例具体说明试纸条的结构和检测方法。实施例一參见图2、图3。图中I为支撑层，用塑胶薄片条制成，2为吸附纤维层，用玻璃纤维棉制成，磷光抗体纤维层3上吸附有抗CIM单克隆抗体的磷光抗体玻璃纤维棉，纤维素膜层4采用硝酸纤维素膜，手柄端的吸水材料层5用吸水滤纸制成，将吸附纤维层2、磷光抗体纤维层3、纤维素膜层4、吸水材料层5各层从右至左粘贴固定在支撑层I上，各层彼此之间交界处的纤维互相交叉滲透。在纤维素膜层4上设有隐形检测印迹6，用偶联CM的牛血清白蛋白溶液(BSA)制成；隐形对照印迹7用羊抗抗体溶液在纤维素膜上印迹制成 “ I ”，两条印迹带平行排列，形成组合印迹带“ Il ”。8-1为覆盖在吸附纤维层2和磷光抗体纤维层3上面的样品端白色保护膜，8-2为覆盖在吸水材料层5上面的其它颜色保护膜(如黄色)，9为样品标记线，该标记线位于吸附纤维层2与磷光抗体纤维层3交界处对应的白色保护膜偏向吸附纤维层2 —侧约O. 5cm处，在标记线右侧保护膜上印有箭头及max字样。待测样品的制备及检测操作步骤
检测肉样将样品剪碎、磨细，以生理盐水稀释成I :5的待测样品悬液。coos ] 操作方法将检测cna式纸条样品端插入待测样品中，插入深度不超过标记线，约 ο秒钟取出试纸条，在紫外光激发下观测結果。结果判定(a)阳性如果在纤维素膜上显示有一条蓝白色印迹带“ I ”，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有CIM; (b)阴性如果在纤维素膜上显示有两条蓝白色印迹带“ Il ”，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含CIM;(c)失效如果在纤维素膜上没有蓝白色带显示，则表明试纸条已失效。
实施例ニ 试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于磷光抗体纤维层3吸附有抗CIM的多克隆抗体，吸附纤维层2用尼龙膜制成，纤维素膜层4采用纯纤维素膜，隐形检测印迹和隐形对照印迹均为“十”，8-2为覆盖在吸水材料层5上面的手柄端兰色保护膜。
用于检测奶样用生理盐水将奶样稀释制成I :2 I :5的待测样品悬液。操作方法将检测cna式纸条样品端插入待测样品中，插入深度不超过标记线，约 ο秒钟取出试纸条，通过荧光阅读器直接读值，数值为τ线和c线的荧光強度，根据峰值或峰面积绘制标准曲线，计算实际含量。
实施例三试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于吸附纤维层2用聚偏ニ氟こ烯PVDF膜制成，偶联CM的载体蛋白溶液为鸡卵清白蛋白(OVA)，隐形对照印迹7用兔抗小鼠IgG抗体溶液在纤维素膜上制成，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜，8-2为覆盖在吸水材料层5上面的手柄端緑色保护膜，隐形检测印迹带和隐形对照印迹带均为“I”。用于检测血样提取血清并用生理盐水将其稀释制成I :2 10的待测样品。结果判定和操作方法均同实施例一，不重述。实施例四试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于吸附纤维层2用聚酯膜制成，纤维素膜层4采用羧化纤维素膜，隐形检测印迹6中偶联CIM的载体蛋白溶液为血蓝蛋白(KLH)。用于检测尿样，可直接取尿液作为待测样品；检测印迹带和对照印迹带均为“I”。操作方法和结果判定方法同例一。实施例五试纸条结构和实施例一基本相同，不同之处在于隐形对照印迹7用羊抗兔IgG抗体溶液在纤维素膜上制成，吸附纤维层2用尼龙膜制成。检测印迹带和对照印迹带均为“卜”。检测样品、结果判定和操作方法同例一。实施例六和实施例一基本相同，不同之处在于磷光抗体纤维层3吸附有抗CIM的多克隆抗体，检测样品为奶样；检测印迹带和对照印迹带均为”。实施例七和实施例一基本相同，不同之处在于磷光抗体纤维层3吸附有抗CIM的多克隆抗体，检测样品为血样。实施例八和实施例一基本相同，不同之处在于磷光抗体纤维层3吸附有抗CIM多克隆抗体，检测样品为尿样。实施例九和实施例一基本相同，不同之处在于隐形检测印迹6中偶联CIM载体蛋白溶液为血蓝蛋白(KLH)。实施例十和实施例一基本相同，不同之处在于隐形检测印迹6中偶联CM载体蛋白溶液为鸡卵清白蛋白(0VA)。实施例十一本发明试纸条的灵敏性、特异性检测
I、灵敏性的检测用磷酸盐缓冲溶液PBS (PH7. 4)或双蒸水分别配置浓度为4、2、
1、0· 5,0. 25,0. 125,0. 0625、0ng/mL的CM标准品，以实施例ー的试纸条为例，试纸条上样SO-IOOuL，反应5-10分钟后，在紫外光下观察結果。对紫外光下反应后的试纸拍照，将图片用画图工具打开，用矩形工具选择T线区域，測定其光度值(Lt)，减去T线(检测线)和C线(对照线)之间的背景光度值(Lb)，以抑制率Lt-Lb为纵坐标，以不同CIM浓度的对数值为横坐标，绘制标准抑制曲线，进行相关回归分析，计算对该试纸条对CIM的IC5tl和最低检测限。经测定，该试纸条对CM的曲线回归方程为y = -50. 637x + 133. 1，相关系数为R2 =
O.9923，根据回归方程计算出该试纸对CM的IC5tl为437. 62pg/mL，该试纸条的最低检测限为111.85pg/mL。可见，该试纸条对CM具有较高的灵敏度。其他例子中试纸条的检测结果和此类似。參见图4。2、特异性的检测以CM的同类药物莱克多巴胺、盐酸克伦特罗以及磺胺间甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、噁喹酸、青霉素、四环素氯霉素、新霉素、喹こ醇作为竞争物，配置上述标品的浓度为lmg/mL，用实施例一的试纸条检测其抑制率，以试纸条对CM的IC5tl与各竞争物的IC5tl的百分比为其交叉反应率。測定结果见下表I。可看出，试纸条的特异性较好，与其他药物均无交叉反应。其
他例子中试纸条的检测结果和此类似。
权利要求
1.ー种磷光二氧化硅纳米颗粒标记的检测西马特罗的免疫层析试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、磷光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其特征在于在纤维素膜层上设有用偶联西马特罗的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述磷光抗体纤维层采用吸附磷光抗体的玻璃纤维棉制成，磷光抗体采用磷光二氧化娃纳米颗粒标记的西马特罗抗体。
2.根据权利要求I所述的免疫层析试纸条，其特征在于所述磷光二氧化硅纳米颗粒的粒径为100-220nm。
3.根据权利要求2所述的免疫层析试纸条，其特征在于所述磷光二氧化硅纳米颗粒标记的西马特罗抗体由以下方法制备，具体步骤为 (O磷光二氧化硅纳米颗粒的氨基化将Ig磷光二氧化硅纳米颗粒分散在甲苯溶液中，加入O. 3-lmL 3-氨丙基三こ氧基硅烷，回流12-24h ;回流液冷却后6500rpm离心5-10min，将得到的沉淀用无水こ醇洗涤，再将沉淀分散在无水こ醇中； (2)西马特罗抗体的标记将西马特罗抗体置于2-8°C、浓度O. 025-0. 05 mol/L、pH9. 5的CBS缓冲液中透析8_12h ;将氨基化的磷光二氧化硅纳米颗粒10000-13000rpm离心4_8min,用所述CBS缓冲液洗漆，然后与透析的西马特罗抗体混合均匀，于2-8°C反应，过夜，得到磷光二氧化硅的抗体复合物；向所得的抗体复合物中按I :50-120的体积比加入O. 5mol/L的氰基硼氢化钠溶液，混匀，2_8°C反应8_12h ;用质量浓度2%的BSA溶液封闭过夜，10000-13000rpm离心4_8min，得沉淀；将沉淀用O. 5mL、浓度O.01-0. 02mol/L、pH7. 8 的 Tris-HCL 缓冲液洗涤后，4°C保存，备用。
4.根据权利要求I所述的免疫层析试纸条，其特征是所述吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏ニ氟こ烯膜或聚酯膜；吸水材料层用吸水滤纸，支撑层用不吸水的韧性材料；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜；偶联西马特罗的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白。
5.根据权利要求I所述的免疫层析试纸条，其特征是所述隐形检测印迹和隐形对照印迹为平行排列的“ Il ”直线式印迹，或“十十”字型排列印迹，或“Τ ~Γ”字型排列印迹，或“ _L I”字型排列印迹，或“トト”字型排列印迹，或“ H ”字型排列印迹。
6.根据权利要求I所述的免疫层析试纸条，其特征是所述保护层为吸附纤维层、磷光抗体纤维层及吸水材料层上覆盖的保护膜；在吸附纤维层与磷光抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该样品标记线偏向吸附纤维层ー侧O. 3-0. 7cm。
7.根据权利要求1-6任一项所述的免疫层析试纸条，其特征在于所述磷光二氧化硅纳米颗粒采用以下方法制备 按O. 75-1. 5 2 3的体积比量取浓氨水、こ醇、水，置于反应器中混合，搅拌均匀，得到反应液A ;将正硅酸四こ酷、こ醇按1-2. 5 22的体积比混合，搅拌均匀得到溶液B ;将溶液B迅速加入到反应液A中，室温反应2h ；6500rpm离心5min,得沉淀；将沉淀用こ醇超声波洗涤，80°C烘干，于400-800°C下煅烧2-4h，即得到磷光二氧化硅纳米颗粒。
8.权利要求I所述免疫层析试纸条的制备方法，其特征是该方法包括以下步骤 (1)西马特罗单克隆抗体或多克隆抗体的制备； (2)磷光抗体纤维层的制备包括磷光二氧化硅纳米颗粒的氨基化、西马特罗抗体的标记和纤维层的制备； (3)吸附纤维层的制备吸附纤维层用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏ニ氟こ烯膜或聚酯膜制成； (4)纤维素膜层的制备纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜，用点样仪在纤维素膜上不同位置分别喷点检测印迹和对照印迹，烘干后备用； (5)试纸条的组装将吸附纤维层、磷光抗体纤维层、纤维素膜层、吸水材料层从右至左依次贴在带有粘合剂的支撑层上，依次将支撑层、吸附层和保护层组装成试纸条。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于磷光抗体纤维层的制备方法如下 (O磷光二氧化硅纳米颗粒的氨基化将Ig磷光二氧化硅纳米颗粒分散在甲苯溶液中，加入O. 3-lmL 3-氨丙基三こ氧基硅烷，回流12-24h ;将回流液冷却后6500rpm离心5-10min，得到的沉淀用无水こ醇洗涤，再将沉淀分散在无水こ醇中； (2)西马特罗抗体的标记将西马特罗抗体置于2-8°C、浓度O.025-0. 05 mol/L、pH9. 5的CBS缓冲液中透析8_12h ;将氨基化的磷光二氧化硅纳米颗粒10000-13000rpm离心4_8min,用所述CBS缓冲液洗漆,然后与透析的西马特罗抗体混合均匀，于2-8°C反应，过夜，得到磷光二氧化硅的抗体复合物；向抗体复合物中按I :50-120的体积比加入O. 5mol/L的氰基硼氢化钠溶液，混匀，2-8°C反应8_12h ;用质量浓度2%的BSA溶液封闭过夜，10000-13000rpm离心4-8min，得沉淀；将沉淀用O. 5mL、浓度O. 01-0. 02mol/L、pH7. 8的Tris-HCL缓冲液洗涤后，4°C保存； (3)磷光抗体纤维层的制备将制备的磷光二氧化硅抗体复合物用含有2%酪蛋白的Tris缓冲液稀释100-1000倍，然后将作为标记物垫的玻璃纤维棉浸入其中，以浸湿为准，冻干，备用；所述Tris缓冲液的浓度为10 mM，pH值为7.8。
10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于所述磷光二氧化硅纳米颗粒采用以下方法制备 按O. 75-1. 5 2 3的体积比量取浓氨水、こ醇、水，置于反应器中混合，搅拌均匀，得到反应液A ;将正硅酸四こ酷、こ醇按1-2. 5 22的体积比混合，搅拌均匀得到溶液B ;将溶液B迅速加入到反应液A中，室温反应2h ；6500rpm离心5min,用こ醇超声波洗漆,80°C烘干,于400-800°C下煅烧2-4h，即得到磷光二氧化硅纳米颗粒。
全文摘要
本发明涉及一种用磷光二氧化硅纳米颗粒标记的西马特罗免疫层析试纸条及其制备方法。试纸条含有支撑层、吸附层和保护层，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、磷光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有用偶联西马特罗的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，还设有用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；磷光抗体纤维层采用吸附磷光抗体的玻璃纤维棉制成，磷光抗体采用磷光二氧化硅纳米颗粒标记的西马特罗抗体。本发明的试纸条特异性强，灵敏度高，简便，直观，准确，可进行定量和定性检测，最低可检测到匹克级的痕量残留，适用范围广，成本低，易于推广应用。
文档编号G01N33/558GK102866252SQ20121028158
公开日2013年1月9日 申请日期2012年8月9日 优先权日2012年8月9日
发明者职爱民, 张改平, 胡骁飞, 赵东, 宋春美, 杨继飞 申请人:河南省农业科学院