一种miRNA分子作为肝癌预后的生物标记物的用途
【专利摘要】本发明涉及一种miRNA分子作为肝癌预后的生物标记物的用途。特别地，本发明涉及hsa-miR-1269a作为肝癌预后标记物中的用途，以及检测hsa-miR-1269a所用的试剂盒。
【专利说明】—种miRNA分子作为肝癌预后的生物标记物的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及肝癌细胞标记物的领域。特别地，本发明涉及一种miRNA分子作为肝癌预后标记物中的用途，所述miRNA分子是hsa-miR-1269a。
【背景技术】
[0002]肝癌是一种恶性度高、预后差的常见肿瘤，各种治疗后复发和转移的几率高达50%以上。如何早期预测肝癌的复发转移是当前的研究热点。已有一些可能能够用来指示肝细胞癌患者预后的指标。这些指标有些是从外周血里检测，有些则是从手术切除的肿瘤组织中获取。其大都是一些核酸(如miRNA等)和蛋白质。以下举一些实例:通过搜索文献发现一些蛋白在肝细胞癌的发生发展中起作用。作者选取其中一个并加以研究。检测一些肝细胞癌患者的肝癌组织和癌旁组织发现激活的增强结合蛋白4(AP-4)和AP-4mRNA相对于癌旁组织在肝癌组织中高表达，并且通过较大量的肿瘤组织的免疫组化得出其余患者的预后相关，表达高者组5年生存率为33.3%表达相对低着5年生存率为67.3%，参见Hu，B.S.等人High expression of AP-4 predicts poor prognosis for hepatocellular carcinomaafter curative hepatectomy.Tumour biology:the journal of the InternationalSociety for Oncodevelopmental Biology and Medicine34, 271-276, do1:10.1007/sl3277-012-0547-4。肝细胞癌患者术后一周外周血中AFP mRNA的表达也可以作为预测术后复发较好的指标，参见，Role of AFP mRNA expression in peripheral blood as apredictor, pdf以及通过对比肝癌组织和癌旁组织miRNA_221的表达发现，其表达与肝细胞癌患者的复发相关，高表达组的无复发生存时间相对低表达组短，参见，Gramantieri, L.等人.MiRNA-22ltargets Bmf in hepatocellular carcinoma and correlates with tumormultifocality.Clin Cancer Res 15，5073-5081，do1:10.1158/1078-0432.CCR-09-0092。
[0003]如之前所报道的，很多和预后有关的指标在不同的研究中得出的结果不尽相同，产生偏倚的可能原因是大部分此类研究都是回顾性研究，不同病因的肝细胞癌和不同人群发生的肝细胞癌其中的分子机制可能不同，例如参见，Singhal, A.，Jayaraman,M., Dhanasekaran, D.N.&Kohli, V.Molecular and serum markers in hepatocellularcarcinoma:predictive tools for prognosis and recurrence.Crit Rev OncolHematol82, 116-140，do1:10.1016/j.critrevonc.2011.05.005(2012).由于大多数研究都是回顾性研究，此类marker (指标)还需要进行前瞻性临床试验区证实它的作用。之前并没有出现做过大规模前瞻性临床试验的与预后相关的标记物的出现。
[0004]miRNA是长约19到25单位的内生性的微小RNA，它通过与靶信使RNA的3’ UTR的特异性结合从而调节靶基因的表达。大量的试验证明了其在肿瘤的发生发展中miRNA发挥了重大的作用。
【发明内容】
[0005]本发明的发明人利用两个影响学诊断肝脏多发占位的病人的模型进行分析，发现一种miRNA分子、hsa-miR-1269a的表达与肝癌预后相关。而在这之前甚至没有报道hsa-miR-1269a和肝癌预后的相关。
[0006]hsa-miR-1269a 的序列如 SEQ ID NO:1 所示(CUGGACUGAGCCGUGCUACUGG)
[0007]本发明提供了一种miRNA分子作为分子标记物在制备用于鉴定肝癌患者预后的试剂中的用途，所述miRNA分子是如SEQ ID NO:1所示的hsa_miR-1269a。
[0008]进一步地，所述试剂用于检测检测作为分子标记物的hsa-miR_1269a的方法中。
[0009]进一步地,检测作为分子标记物的hsa-miR_1269a的方法包括southern印迹、northern印迹、聚合酶链式反应(PCR)、逆转录酶PCR (RT-PCR)、定量实时PCR (qRT-PCR)、纳米阵列、宏阵列、放射自显影和原位杂交。
[0010]另一方面，本发明提供了一种或多种特异地检测如SEQ ID NO:1所示的hsa-miR-1269a的表达水平的引物和/或探针在制备用于鉴定肝癌患者预后的试剂中的用途。
[0011]要进步地，根据本发明所述引物和/或探针包含与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列，或由与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列组成。
[0012]进一步地，根据本发明，所述用途进一步包括:
[0013]a)提供来自个体的肝癌癌组织和癌旁组织的样品；和
[0014]b)确定样品中如SEQ ID NO:1所示的hsa_miR-1269a的表达水平；
[0015]c)比较癌组织和癌旁组织的样品中hsa-miR_1269a的表达水平。
[0016]特别地，在所述步骤(b)使用选自宏阵列筛选、微阵列筛选、纳米阵列筛选、逆转录PCR、实时PCR或原位PCR的方法进行。
[0017]更特别地，高水平的hsa-miR-1269a表达水平是具有降低的无复发生存率的指征。
[0018]“降低的无复发生存率”的意思是当与低水平的hsa-miR-1269a表达的肝细胞癌患者相比时，高水平的hsa-miR-1269a表达的肝细胞癌患者无复发存活的概率较低，例如所述概率可以降低至少0.05,0.1,0.2,0.3,0.4或0.5或更多。
[0019]“高水平的hsa-miR-1269a表达”指与癌旁组织相比，癌组织的双重特异性蛋白激酶蛋白和/或mRNA的表达量高至少10%，例如高20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、120%、150%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、1500%、2000%、3000%、4000%、5000%、10000% 或更多。
[0020]“低水平的hsa-miR_1269a表达”的意思是癌组织的双重特异性蛋白激酶蛋白和/或mRNA的量与癌旁组织中的量无统计学上的不同。
[0021]另一方面，本发明提供了一种用于鉴定肝癌患者预后的试剂盒，其包括一种或多种特异地检测如SEQ ID NO:1所示的hsa-miR-1269a的表达水平的引物和/或探针。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1表示进行二代测序的两个具有代表性患者的腹部CT片。图中左方是一个符合“转移理论”的肝细胞癌患者的腹部CT片，其中箭头所指的P1-P是肝细胞癌的原发灶，P1-M:原发肿瘤的卫星灶。P1-V:是静脉内癌灶；图中右方的是一个符合“多中心起源理论”患者的腹部CT平扫，箭头所示的区域P I1-L是表示的左肝癌灶，P I1-R表示的是右肝癌灶。
[0023]图2A表示ROC曲线，其分析了检测的所有患者癌组织和癌旁组织的hsa_miR-1269a 表达值。
[0024]图2B表示用Kaplan-Meier法绘制的生存曲线。从生存率曲线中可以看出，hsa-miR-1269a较高的患者组相对于hsa_miR-1269a表达低的患者组生存率较低。
[0025]应当了解，所附附图并非按比例地显示了本发明的基本原理的图示性的各种特征的略微简化的画法。本文所公开的本发明的具体设计特征包括例如具体尺寸、方向、位置和外形将部分地由具体所要应用和使用的环境来确定。
[0026]在这些图形中，贯穿附图的多幅图形，附图标记引用本发明的同样的或等同的部分。
【具体实施方式】
[0027]发明人先对比较具有代表意义的两个典型临床病例进行了多组学的研究。这两个临床病例的特征为同样是影像学诊断肝脏多发占位(如图1所示)，做手术切除后证实都为乙肝相关性肝细胞癌。第一个患者是有低分化肝内播散灶的患者，其术后3个月即死亡，该患者符合临床上转移模型的理论，第二个患者是有高分化肝细胞癌患者，其术后两年仍无复发，该患者符合多中心起源的理论。
[0028]我们对这两个患者手术切除下的多个瘤灶(包括第一个患者的原发灶、转移灶、静脉癌栓和第二个患者的两个独立癌灶)、他们的癌旁组织共7个组织样本，其中，两个患者每人各一个癌旁组织样本、第一个患者有3个癌组织样本和第二个患者的两个癌组织样本，一共7个癌组织，以及背景的生殖细胞系进行了 miRNA-seq(华大基因)。具体操作步骤如下:从组织中抽提总RNA并对总RNA进行样品检测，样品检测合格后，通过PAGE回收18 — 30或40nt的小RNA片段，两端加5’和3’接头后(建文库)，反转录成cDNA并PCR扩增(RT-PCR)，后 CS 制备并 HiSeq2000 测序(50SE)。
[0029]随后进行了 miRNA的表达分析，从miRNA测序数据分析中得到125条miRNA:首先miRNA表达值的标准化:将各个样本中每个miRNA的map read数目除于该样本中map到基因组的总read数目，作为该基因的表达值。我们选取了 7个样本中map read数目最大值超过1000的miRNAs进行后续分析，共得到125个miRNAs。
[0030]根据所得结果，通过设定以下值筛选与肝癌预后相关的miRNA。
[0031]I)首先挑选7个样品平均表达量较高的miRNA (平均读取数100
[0032]以上的76个miRNA)进行下一步研究；
[0033]2)与癌旁组织相比，至少3个癌样品一致性地上调或下调2倍以上，其他样品在癌组织中的变化倍数为上调2倍至下调2倍之间；也即，如果有3 - 5个样品上调或下调2倍以上，剩余2-0个样品即使相反地下调或上调，其变化倍数也不得超过2倍，上调2倍至下调2倍之间的差异被认作不明显。
[0034]3)查文献和数据库(如收录miRNA研究情况的数据库miR2disease),删除已知的与肝癌相关的miRNA。
[0035]4)对平均表达量和平均差异倍数综合排序，挑出没有明确研究报道的hsa-miR-1269a。[0036]为了进一步证实hsa-miR-1269a与肝癌预后的相关性，发明人利用qRT-PCR的方法在96例乙肝相关肝细胞癌的患者的癌和癌旁组织中检测hsa-miR-1269a的表达情况。具体方法如下:用购自life technologies的TaqmanOassay试剂盒根据厂商的说明书检测癌组织和癌旁组织hsa-miR-1269a的表达量，然后，用U6作为内参基因，对获得的hsa-miR-1269a表达量归一化。
[0037]我们的结果证实了 hsa-miR-1269a确实在癌组织中高表达。我们又将其与患者的临床资料进行综合分析，发现hsa-miR-1269a表达水平和患者的无复发生存率相关。
[0038]实施例1、hsa-miR_1269a与肝癌无复发生存率的相关性
[0039]癌组织和癌旁组织hsa-miR_1269a的表达量经各自内参基因U6的表达量归一化后，通过ROC曲线(如图2A)。找出一个能把癌和癌旁的表达值区分开的阈值，在该阈值点上的敏感性和特异性都是最大的(如图2A)。然后根据这个阈值将病人癌组织hsa-miR-1269a表达进行高低分类，分出高表达患者组n=67，低表达组n=29。
[0040]我们的结果表明，与低表达的患者相比，hsa-miR-1269a高表达的患者的无复发生存率较低，如图2B所示。
[0041]至此我们发现检测肝细胞癌患者中hsa-miR_1269a的表达量可以预测病人的预后。
【权利要求】
1.一种miRNA分子作为分子标记物在制备用于鉴定肝癌患者预后的试剂中的用途，所述 miRNA 分子是如 SEQ ID NO:1 所示的 hsa_miR-1269a。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述试剂用于检测作为分子标记物的hsa_miR-1269a 的方法中。
3.根据权利要求2所述的用途，其中检测作为分子标记物的hsa-miR-1269a的方法选自southern印迹、northern印迹、聚合酶链式反应、逆转录酶PCR、定量实时PCR、纳米阵列、宏阵列、放射自显影或原位杂交。
4.一种或多种特异地检测如SEQ ID NO:1所示的hsa_miR-1269a的表达水平的引物和/或探针在制备用于鉴定肝癌患者预后的试剂中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述引物和/或探针包含与SEQID N0:1互补的核苷酸序列，或由与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列组成。
6.根据权利要求1至5任一项所述的用途，其进一步包括: a)提供来自个体的肝癌癌组织和癌旁组织的样品；和 b)确定样品中如SEQID NO:1所示的hsa_miR-1269a的表达水平； c)比较癌组织和癌旁组织的样品中hsa-miR-1269a的表达水平。
7.根据权利要求6所述的用途，其中在所述步骤b)中使用选自宏阵列筛选、微阵列筛选、纳米阵列筛选、逆转录PCR、实时PCR或原位PCR的方法进行。
8.根据权利要求6所述的用途，其中高水平的hsa-miR-1269a表达水平是具有降低的无复发生存率的指征。
9.一种用于鉴定肝癌患者预后的试剂盒，其包括一种或多种特异地检测如SEQ ID NO:I所示的hsa-miR-1269a的表达水平的引物和/或探针。
10.根据权利要求9所述的用于鉴定肝癌患者预后的试剂盒，其中所述引物和/或探针包含与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列，或由与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列组成。
【文档编号】G01N33/68GK103616518SQ201310606743
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】赵海涛, 张浩海 申请人:赵海涛