绿色荧光蛋白gfp的荧光定量检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于绿色荧光蛋白(GFP)的荧光定量检测方法。其主要特征在于：(1)光学检测系统采用了半透半反镜与光纤相结合的方法，确保了检测灵敏度，同时降低了系统复杂度；(2)激发光源采用了LED，荧光检测采用了光敏二极管，有效降低了系统体积与成本；(3)GFP定量采用了实时定标的方法，通过实时的定标模型来克服由标准品或检测系统带来的系统误差，确保了检测精度。所述的GFP荧光定量检测方法，在一个高通量荧光检测平台上实现，其主要特征在于，通过两维运动平台，实现96孔检测板中，单个孔位的定位与检测。本发明涉及的GFP荧光检测方法及系统具有灵敏度高、定量准确等特点，为基于GFP的标志物检测提供了一条简便、可靠的途径。
【专利说明】绿色荧光蛋白GFP的荧光定量检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于荧光的生物标志物检测方法，尤其涉及一种用于绿色荧光蛋白(GFP)的荧光定量检测方法。该检测方法通过对GFP的荧光强度进行检测，结合实时定标模型，实现绿色荧光蛋白的定量检测，属于生物诊断检测领域。
【背景技术】
[0002]基于荧光的生物标志物检测方法具有特异性高、灵敏度高、准确度高、动态范围宽等优点，广泛应用于生命、医学检测及诊断中。传统的荧光检测系统中，为了获取理想的点光源，确保足够的激发强度，往往采用体积较大的激光作为激发光源；另一方面，为了确保检测灵敏度，光电检测器也往往选择价格较为昂贵的光电倍增管。为了减小荧光检测系统的体积，降低系统成本，“LED+光敏二极管”的组合方式正在被越来越多的光电检测系统所采纳。荧光检测中，独立的激发光路与接收光路往往需要依靠精巧的位置校准方法来实现激发光路、检测点、及接收光路的三点汇聚。通过引入半透半反镜，可以将激发光路与接收光路部分的统一起来，特别是将两者与检测点的接口合二为一，显著降低了位置校准的复杂度。然而，现有的大部分荧光检测系统(发明专利:上转换磷光免疫层析试纸条检测系统(申请号:200510030549.6)，一维多重检测上转换磷光生物传感器(申请号:200610027354.0))，由于采用了激发光源、光电检测器、与检测信号点之间直接耦合的工作模式，三者之间的位置关系受到约束，降低了系统的灵活度。另外，该类检测系统的光学模块往往包括多个透镜模组，结构复杂，容易引起检测性能的不稳定。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是针对上述【背景技术】中的不足，提供一种基于光纤技术的GFP荧光检测方法。与现有方法不同，通过引入光纤技术，来实现激发光路、接收光路、及公共检测接口的相互耦合。一方面，允许检测点到光敏二极管及其所在的信号处理电路板之间存在一定的距离，增强了系统实现的灵活度；另一方面，节省了若干聚焦透镜，进一步降低了检测系统的复杂度。
[0004]本发明是通过以下技术方案实现的。本发明涉及的光纤检测模块主要包括:聚焦透镜、半透半反镜、激发光路光纤、接收光路光纤、LED、光敏二极管、滤光片组，以及固定套筒等。其中聚焦透镜为激发光路与接收光路所共用，为光纤检测模块与荧光检测点之间的公共接口。半透半反镜对不同波长的光起到分光的作用，具体来讲，在本发明中，通过选择合适的半透半反镜，使得LED发出的激发光能够经其反射，入射到荧光检测点上；同时，检测点激发出来的荧光则能够经过半透半反镜透射到光敏二极管。半透半反镜通过激发光纤与LED实现激发光路的耦合。半透半反镜通过接收光纤与光敏二极管实现接收光路的耦合。在激发光纤与接收光纤的端面上分别嵌入了相应规格的滤光片，以确保实际激发光的波长在允许范围之内；同时，滤除进入接收光纤的，非特定荧光波长的干扰光，降低背景噪声，提高检测准确度。[0005]本发明实现的技术方案中，还包括了一种高通量检测方法来实现GFP的实时定标检测。该高通量检测系统由“X-Y”两维运动平台所驱动，由嵌入式系统控制。在操作界面的指引下，借助该高通量扫描运动平台，可以实现对包括标准品、及待测样品在内的多个样品的批量化检测。同时，利用多个标准品检测结果建立的实时定标模型，来推算待测样品的浓度定量信息。这种依靠高通量检测平台实现的实时定标检测方法，有利于克服由于标准品状态的不稳定性、待测样品状态的不稳定性、检测试剂状态的不稳定性、以及系统各个硬件模块的不稳定性所带来的各类系统偏差，确保检测结果的准确性。
[0006]本发明具有实质性特点和显著进步，本发明主要采用了四项技术措施:1)通过引入半透半反镜，实现了针对单一检测点，激发光路与接收光路的物理接口统一。2)通过引入光纤技术，实现了检测点与激发光源和光敏二极管之间的柔性耦合，提高了系统实现的灵活度。3)通过引入实时定标的检测技术，有效克服了各类影响因素可能导致的系统偏差。
4)通过引入两维运动平台，在嵌入式系统控制下，实现各个孔位的单点检测，提高了检测系统的工作效率，改善了检测过程的操作方便性。本发明采用了上述技术措施使得提出的GFP荧光检测方法，具有结构简单、灵活度高、准确度高、操作简便的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1光纤检测模块的结构示意图
[0008]图2高通量检测平台的结构示意图
【具体实施方式】
[0009]如图1所示，本发明涉及的光纤检测模块主要包括:聚焦透镜1、半透半反镜2、激发光路光纤3、接收光路光纤4、LED5、光敏二极管6、激发滤光片7、接收滤光片8，以及固定套筒9等组件。其中，LED5在恒流源的驱动下，发出强度稳定、特定波长的激发光，通过LED5与激发光路光纤3的直接耦合，大部分的激发光进入了光纤3，经过光纤3另外一个端面的激发滤光片7，滤除其它波长的杂散光，随后经过半透半反镜2反射到聚焦透镜1，最终经聚焦透镜I出射的激发光在预定的焦距位置处，形成了一个一定大小的激发光斑。在激发光斑的激励下，待测GFP样品受激发出的荧光，首先通过聚焦透镜I汇聚到半透半反镜2，再通过半透半反镜2透射到接收滤光片8，随后进入接收光路光纤4，直至最终到达光电传感器光敏二极管6。光敏二极管6上面的PN结，将光信号转换为光电流，随后经过1-V放大电路的处理，得到微弱的电压信号，为了提高检测灵敏度，可以将原始的电压信号进一步放大到A/D转换器允许的量程范围，最终完成信号的测量。光纤检测模块中聚焦透镜1、半透半反镜2，以及光纤3和4的工作端面均封闭在固定套筒9中。
[0010]如图2所示，本发明涉及的高通量检测平台主要包括:X方向运动导轨1、Y方向运动导轨2、X方向驱动电机3、Y方向驱动电机4、X方向运动皮带5、Y方向运动皮带6、检测板载物检测台7、光电检测头8、X方向定位光栅9、Y方向定位光栅10,以及嵌入式测控系统11等。将检测板(如标准的96孔板)放置在载物检测台上面，嵌入式测控系统9控制X方向驱动电机3,通过X方向运动皮带5,带动上层运动平台沿着X方向运动导轨I运动到指定位置(运动位置通过X方向定位光栅9来确定)，然后，嵌入式测控系统9控制Y方向驱动电机4,通过Y方向运动皮带6,带动检测板载物检测台7沿着Y方向运动导轨2运动到指导位置(运动位置通过Y方向定位光栅10来确定)。嵌入式测控系统通过光纤检测模块的光电检测头8，对单个检测孔实施信号采集，然后，再采用类似的方法，让下一个检测孔位运动到光电检测头8的下方，再对其实施光电信号采集，直至本次检测中的所有孔位检测完毕。根据所有检测孔位的检测结果，建立实时的标准品检测模型，再依据该模型来推算待测样品的浓度。
【权利要求】
1.一种基于光纤技术的GFP荧光检测方法，具体的荧光检测光纤模块包括:聚焦透镜(I)、半透半反镜(2)、激发光路光纤(3)、接收光路光纤(4)、LED (5)、光敏二极管(6)、激发滤光片(7)、接收滤光片(8)，以及固定套筒(9)等组件。其中，LED(5)在恒流源的驱动下，发出强度稳定、特定波长的激发光，通过LED(5)与激发光路光纤(3)的直接耦合，大部分的激发光进入了光纤(3)，经过光纤(3)另外一个端面的激发滤光片(7)，滤除其它波长的杂散光，随后经过半透半反镜(2)反射到聚焦透镜(I)，最终经聚焦透镜(I)出射的激发光在预定的焦距位置处，形成了一个一定大小的激发光斑。在激发光斑的激励下，待测GFP样品受激发出的荧光，首先通过聚焦透镜(I)汇聚到半透半反镜(2)，再通过半透半反镜(2)透射到接收滤光片(8)，随后进入接收光路光纤(4)，直至最终到达光电传感器光敏二极管(6)。光敏二极管(6)上面的PN结，将光信号转换为光电流，随后经过1-V放大电路的处理，得到微弱的电压信号，为了提高检测灵敏度，可以将原始的电压信号进一步放大到A/D转换器允许的量程范围，最终完成信号的测量。
2.根据权利要求1所述的GFP荧光检测方法，其特征是，激发光源LED(5)及光敏二极管(6)到检测点的光路分别是通过激发光路光纤(3)与接收光路光纤(4)耦合得到的。
3.根据权利要求1所述的GFP荧光检测方法，其特征是，激发光路光纤(3)与接收光路光纤(4)通过一个半透半反镜(2)相互耦合，得到了一个面向检测点的公共光电检测接口。
4.根据权利要求1所述的GFP荧光检测方法，其特征是，在激发光路光纤(3)与接收光路光纤(4)的端面上分 别嵌入了一个激发光滤光片(7)与一个接收光滤光片(8)。
5.根据权利要求1所述的GFP荧光检测方法，其特征是，激发光路光纤(3)与接收光路光纤(4)的工作端面分别直接与LED (5)与光敏二极管(6)相互耦合。
6.根据权利要求1所述的GFP荧光检测方法，其特征是，其检测过程采用了实时定标的方法，即让待测样品与标准品同时检测，通过实时建立的标准品校准模型来推算待测样品的浓度。
7.根据权利要求1所述的GFP荧光检测方法，其特征是，包括待测样品、标准品等在内的多个样品检测过程，是通过一个高通量两维检测平台来实现的。
【文档编号】G01N21/64GK103616359SQ201310638365
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】邹明强, 张孝芳, 李莉, 刘彩虹, 齐小花, 刘峰 申请人:中国检验检疫科学研究院