一种用于检测白血病的试剂盒的制作方法

文档序号:11474454阅读:227来源:国知局
本发明属于生物检测领域,涉及一种用于检测白血病的试剂盒。血管生成素样蛋白3(angio-poietin-likeprotein3,angptl3)是一种分泌性蛋白因子,具有促进肿瘤新生血管形成的作用。conklin发现并克隆angptl3基因,在人和小鼠中分别定位于1号和4号染色体,包括7个外显子和6个内含子。其表达产物angptl3是分子量约为70kda的分泌蛋白,人angptl3特异性的表达于肝脏,在人肾脏也有少量表达。angptl3是一种分泌性蛋白因子即人angptl3是由ip31编码的460个氨基酸组成的多肽,其蛋白结构由分泌信号肤、n-端螺旋形卷曲结构域和c-端fbn样区组成.最先发现在发育的肝脏中特异的表达,成人肝脏中也有少量持续表达.和促血管生成素家族不同,angptl3的fbn区和他们只有37%-39%的同源区,故不能和tic2受体结合,但其fbn样区可以和整合素ανβ3结合.camenisch等研究发现angptl3通过和内皮细胞表面整合素ανβ3结合,导致内皮细胞黏附、迁移,刺激整合素信号转导途径包括akt,mapk,fak磷酸化.已经发现整合素ανβ3不仅可以影响肿瘤细胞的增殖和迁移,也和肿瘤血管的生成相关,国外已有通过抑制其表达来治疗肿瘤的临床实验研究.此外ανβ3还和肝星形细胞的增殖和凋亡相关,因此也可能影响肝纤维化过程.动物实验发现ngptl3和vegf具有相似的促进鼠角膜血管生长活性.可能和vegf一样,angptl3同样具有促进肿瘤新生血管形成,从而诱发侵袭转移作用.其中angptl3和肿瘤新生血管形成的关系尚未见报道.宋其同等还发现,angptl3mrna表达和肿瘤新生血管生成,癌栓的形成和肿瘤分级相关,而和肿瘤大小,包膜的完整性无明显相关,因此认为angptl3在hcc的侵袭和转移中发挥重要作用,可以促进肿瘤血管形成以及hcc的侵袭和转移;可以通过angptl3的表达强度判断hcc的预后,设想通过调控ang-ptl3的表达以控制血糖,并抑制肿瘤血管生成。目前的研究表明,angptl3在人肝癌组织、癌旁肝组织中均表达,但在肝癌组织中表达明显高于癌旁组织.同时发现肿瘤血管密度较高的肿瘤组织,其angptl3表达也较高.研究表明angptl3的表达与肿瘤血管生成呈正相关,表明其可能在促进hcc的发生、发展及转移过程中起着重要作用。同时angptl3本身作为活性蛋白质也参与脂质代谢及血管生成过程,通过激活不同靶蛋白协同其他活性物质完成其生理功能。进一步了解angptl3可能的调控因素、生物学效应及作用通路,对于寻找与其相关疾病新的治疗途径有积极意义。急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia,aml)是一种异质性髓细胞肿瘤,也称急性非淋巴细胞性白血病,常进展迅速,其特点是由造血干细胞恶变而形成的原始细胞克隆取代了正常骨髓造血。由于白血病细胞代替了正常血细胞,它们不具备正常血细胞的功能,由此导致贫血,血小板和粒细胞减少而引发一系列并发症。若不经过治疗,存活期一般不超过半年。有的病例从诊断到死亡,甚至不过一周,死亡的主要原因是出血和感染。检测急性髓系白血病目前主要通过测血液组分来实现,但是目前对于angptl3与白血病的关系没有相关报道。技术实现要素:根据第一方面,本发明提供一种检测急性髓系白血病该方法包括通过检测angptl3在血液中的表达水平,来鉴定时候患有急性髓系白血病。本发明的另外一方面,提供一种检测急性髓系白血病的试剂盒,该试剂盒中包含有特异性结合angptl3的单克隆抗体,以及elasa检测相关的试剂以及酶标板。所述的试剂盒中还包括:固相载体(如多孔板);较佳地,单克隆抗体包被于所述的固相载体;较佳的,所述的单克隆抗体还连接有标记物。在另一优选例中,所述的标记物选自:辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、3-d-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、荧光素或葡萄糖淀粉酶。在另一优选例中,所述的试剂盒中还包括:与标记物相对应的底物;显色剂;]洗涤液;和/或终止液。在本发明的另一方面,提供所述的试剂盒的用途,用于特异性检测急性髓系白血病。在另外一个方面,本发明提供一种angptl3的单克隆抗体,其重链可变区序列如seqidno:1所示,其轻链可变区如seqidno:2所示。在另外一个方面,本发明提供一种angptl3的单克隆抗体,其重链可变区序列如seqidno:3所示,其轻链可变区如seqidno:2所示。在另外一个方面,本发明提供一种angptl3的单克隆抗体,其重链可变区序列如seqidno:4所示,其轻链可变区如seqidno:2所示。在另外一个方面,本发明提供一种angptl3的单克隆抗体,其重链可变区序列如seqidno:5所示,其轻链可变区如seqidno:2所示。在另外一个方面,本发明提供一种angptl3的单克隆抗体,其重链可变区序列如seqidno:6所示,其轻链可变区如seqidno:2所示。在另外一个方面,本发明提供一种angptl3的单克隆抗体,其重链可变区序列如seqidno:7所示,其轻链可变区如seqidno:2所示。在另外一个方面,本发明提供一种angptl3的单克隆抗体,其重链可变区序列如seqidno:8所示,其轻链可变区如seqidno:2所示。在另外一个方面,本发明提供一种angptl3的单克隆抗体,其重链可变区序列如seqidno:9所示,其轻链可变区如seqidno:2所示。在另外一个方面,本发明提供一种angptl3的单克隆抗体,其重链可变区序列如seqidno:10所示,其轻链可变区如seqidno:2所示。在另外一个方面,本发明提供一种angptl3的单克隆抗体,其重链可变区序列如seqidno:11所示,其轻链可变区如seqidno:2所示。在另外一个方面,本发明提供一种angptl3的单克隆抗体,其重链可变区序列如seqidno:12所示,其轻链可变区如seqidno:2所示。本发明高的另外一个方面,其中所述单克隆抗体是抗体片段。优选的,其中所述抗体片段选自scfv片段、fab片段、f(ab’)2片段和fab’片段。发明的有益效果本发明通过大量的实验和数据分析发现了angptl3与白血病表达密切相关,angptl3可以作为检测靶标用于白血病的快速检测中的用途。另外,发明人通过提供了改进的angptl3单克隆抗体,从而用于构建检测angptl3的表达量的试剂盒从而为快速检测白血病打下了坚实的基础,并且所述试剂盒成本低廉,制备简单,不需要大型仪器,即可快速实现目的蛋白的定量,从而实现物美价廉的白血病的检测。具体实施方式发明人在前期通过蛋白质组学分析大数据比对,发现了angptl3在白血病患者和正常人群中表达有显著差异,因此,初步判定angptl3可以作为检测白血病的初步靶标。实施例1白血病患者和正常人群血液中angptl3表达量的区分取急性髓系白血病患者和正常人群的血液2ml,按总rna抽提试剂盒说明操作提取细胞总rna,用uv法定量分析rna得率和纯度,琼脂糖凝胶电泳分析其完整性。经检测,rna提取成功。cdna合成(10μl反应体系):取mgcl22μl,10×rt缓冲液1μl,无核酸酶蒸馏水3.75μl,dntp混合液1μl,rna酶抑制剂0.25μl,amv逆转录酶0.5μl,随机引物0.5μl,总rna1μl.。逆转录反应条件:30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min,所得产物用于pcr扩增.pcr反应:采用primerpremier5.0软件设计angptl3引物和β-actin引物。angptl3上游引物序列:5′tccagaacacccagaagtaac-3′,下游引物序列:5′-ccagcctcctgaataaccct-3′;β-actin上游引物序列:5′-tcctccctggagaagagcta-3′,下游引物序列:5′-tcaggaggagcaatgatcttg3′.angptl3和β-actin反应同管进行,终体积50μl。pcr反应条件:94℃2min,1个循环;94℃30s,55℃30s,72℃1min,共35个循环.取8μl反应液进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统采集图片,quantityone软件分析,将angptl3与β-actin面积灰度值的比值作为angptl3的mrna表达量参数。结果如表1所示:angptl3的mrna表达量倍数关系患者2.57正常人1从表1可以看出,在患者中angptl3高表达,可以作为特异性的检测靶标。实施例2改进的单克隆抗体的制备首先按照本领域常规的试验方法制备重链可变区序列和轻链可变区序列分别为seqidno:1和2所述的单克隆抗体angptl3-1。另外通过本领域常规的重叠pcr技术,分别在重链可变区seqidno:1的区域中进行突变取代,通过300多个取代以及检测,共发现了12个取代形式可以导致单克隆抗体的效果显著提升,其余280多种均没有提高或者效果远远差于原始抗体,在此不一一列举。按照本领域常规的抗体活性检测方式,分别检测各个单克隆抗体的活性,结果如表2所示:从表2可以看出,经过改造后的单克隆抗体具有较好的亲和性,比原始抗体具有性能上的改进优势。另外检测抗体结合能力(elisa法):以包被缓冲液(50mmna2co3,nahco3ph9.6)稀释angptl3抗原蛋白至2μg/m1,100μl/well,4℃过夜。甩掉板中液体,pbst(ph7.4,0.05%tween-20,v/v)洗板后,3%bsa-pbs封闭1h。将抗体分别从2000ng/ml开始,进行2倍梯度稀释,共11个浓度,稀释液(1%bsa-pbs)作对照,37℃孵育2h。加入羊抗人igg-hrp(goatanti-humanigg-hrpconjugated),孵育1h。加可溶性单组分tmb底物显色液,室温避光显色5-10min。2nh2so450μl/well,终止显色反应。置mdspectramaxplus384酶标仪上读od450nm-650nm值,应用软件sotfmaxprov5.4进行数据处理和作图分析,结果如下表二所示,抗体的结合抗原ec50常数。实施例3试剂盒检测取30例白血病患者血液,10例正常人群的血液各2ml,离心取血清,按照实施例2中(elisa法)用血清代替抗原蛋白进行相应检测,血清的加入量为20微升;通过elasa检测结果发现,在30例白血病患者中均有较强显色,而10例正常人群中显色几乎没有,通过这次检测,可以发现,本发明的试剂盒能够较好的实现白血病患者的区分。实施例4白细胞抑制试验将人人急性髓系白血病细胞株kgla细胞接种于rpmi-1640培养液中,37'c、5%(1)2饱和湿度培养箱内培养传代,接种于96孔培养板,加入溶解于乙醇生理盐水混合液的单克隆抗体(浓度为30ug.ml-1、50ug.ml-1、100ug.ml-1)48h后mtt法测定生长抑制率。试验数据表明,本发明的单克隆抗体对白血病细胞有明显的抑制作用,且生长抑制作用与抗体浓度呈正相关,即随着抗体浓度升高,其对白血病细胞的生长抑制作用越明显。尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导,可以对那些细节进行各种修改和替换,这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。序列表〈110〉苏州立豪生物科技有限公司〈120〉一种用于检测白血病的试剂盒〈210〉1<212>prt<213>人工序列<400>重链可变区gluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallysproglyala151015servallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethrsertyr202530valmethistrpvallysglnlysproglyglnglyleuglutrpile354045glytyrpheasnprotyrasnaspglyt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