一、技术领域
本发明属于环境样品检测领域，具体涉及一种土壤中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的检测方法。
二、
背景技术：
近年来，由于美白和紫外线防护越来越受到人们的重视，防晒剂的使用越来越频繁。防晒剂在人们皮肤上使用后，随着人们活动会直接进入环境中，或者先进入城镇污水处理系统中，再随着污泥和污水的排放进入环境中。很多研究表明，防晒剂可在很多水环境中检出，作为一种新型污染物，已收到环保部门和环境科研工作者的重视。一些研究表明，有机防晒剂在环境中具有内分泌干扰性和生物积累性，对环境具有潜在的危害。
2-苯基苯并咪唑-5-磺酸(2-phenylbenzimidazole-5-sulfonicacid，简称pbsa)是一种常用的防晒剂，由于其优异的防晒性能，被广泛的用于防晒化妆品中。
表12-苯基苯并咪唑-5-磺酸的基本信息
目前针对pbsa的研究主要集中在化妆品和产品中的含量水平，以及水环境中降解机理研究，但是pbsa在土壤中检测方法研究以及含量水平研究几近空白。因此，为了了解土壤环境中pbsa的浓度水平和环境行为，需要建立一种高效快捷、灵敏度高的分析方法，用于土壤中痕量2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的定性定量检测。
三、
技术实现要素：
发明的目的是针对以上问题和不足，在于提供一种土壤中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸(pbsa)的分析检测方法，更具体的说是采用超声萃取、硅胶层析柱净化和高效液相色谱质谱联用仪检测的分析方法。
本发明的技术方案包括以下步骤：
(1)超声萃取
土壤样品采集后，干燥并去除石块和植物组织等较大的杂质，研磨过筛。称取土壤样品于带盖离心管中，滴加内标溶液，待溶剂挥发；加入萃取溶剂，拧紧盖子，混合均匀后，超声萃取，离心分离，吸取上层清液于梨形烧瓶中；重复萃取步骤，将萃取液合并于梨形烧瓶中，并旋转蒸发至干。
(2)硅胶层析柱净化
在玻璃层析柱底部装入少量玻璃棉，依次加入硅胶和无水硫酸钠，平整表面后，加入溶剂清洗和活化硅胶。往梨形烧瓶中加入溶剂重新溶解，并将溶液转移至硅胶层析柱中；用玻璃管接收层析柱中所需的部分流出液，在氮吹仪中吹干。往玻璃管中加入1ml甲醇重新溶解，过滤后，以2ml棕色进样小瓶中保存待测。
(3)标准工作溶液配制
用分析天平称取pbsa和内标物的标准物质，分别配成储备液，并稀释成工作溶液，最后配制成梯度浓度的标准工作溶液。
(4)高效液相色谱质谱联用仪检测
将梯度浓度的标准工作溶液在高效液相色谱质谱联用仪中测定，使用内标法建立标准工作曲线。在相同条件下将步骤(2)中的样品溶液注入高效液相色谱质谱联用仪中进行测定，将样品中目标化合物的色谱峰面积代入标准工作曲线，得到样品中pbsa的定性定量结果。若样品中pbsa的浓度超过标准工作曲线线性范围上线，应相应减少样品量重新提取净化和检测。
步骤(1)中，优选地使用冷冻干燥法，样品研磨后果0.90mm筛子，密封保存于4℃的环境中。
步骤(1)中，土壤样品量优选为5～10g。
步骤(1)中，内标物优选为2-甲基-4-氯戊氧基丙酸(mecoprop)。
步骤(1)中，萃取溶剂为乙酸乙酯和甲酸的混合溶剂，两者体积比为50:1～100:1。
步骤(1)中，具体提取过程为加入萃取溶剂7～10ml，拧紧盖子，涡旋混合30s，超声萃取15～20min，2500rpm离心15min，吸取上层清液于梨形烧瓶中，再重复提取2～3次，合并萃取液于梨形烧瓶中，旋转蒸发至干。
步骤(2)中，硅胶和无水硫酸钠分别为1.0g和0.5g。
步骤(2)中，硅胶活化具体操作为：依次加入10ml甲醇、10ml乙酸乙酯和10ml正己烷，注意过程中液面不能低于无水硫酸钠上界面。
步骤(2)中，样品溶液加入和洗脱的具体过程为：往梨形烧瓶中加入2～3ml正己烷重新溶解，并将溶液转移至硅胶层析柱中，弃去流出液，再重复步骤2次；往梨形烧瓶中加入2～3ml乙酸乙酯重新溶解，并将溶液转移至硅胶层析柱中，用玻璃管接收流出液，再重复步骤2次，合并流出液，于氮吹仪中吹干。
步骤(3)中，优选的内标物为2-甲基-4-氯戊氧基丙酸(mecoprop)，标准工作曲线的梯度浓度至少5个以上。
步骤(4)中，优选的色谱条件如下：色谱柱为agilentsb-c18(3.0×100mm,1.8μm)、柱温为40℃，流动相为水(a)和乙腈(b)；梯度洗脱程序为0～2min50～90％流动相b，2～5min90％流动相b，流速0.30ml/min。
步骤(4)中，优选的质谱条件如下：电喷雾离子化离子源(esi)负模式；干燥气温度300℃，流速3ml/min；雾化器压力30psi；鞘气温度250℃，流速11ml/min；毛细管电压3000v，喷嘴电压1000v。在此条件下，pbsa和内标的质谱参数如表2所示。
表2pbsa和内标在高效液相色谱质谱联用的质谱参数
a粗体为定量离子
本发明利用超声萃取、硅胶层析柱净化和高效液相色谱质谱联用仪检测技术，建立了2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的分析检测方法，有效地对土壤中的痕量2-苯基苯并咪唑-5-磺酸进行定性定量检测，本发明具有以下创新点。
(1)2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的极性较强，本发明使用甲酸酸化的乙酸乙酯作为提取溶剂，可以抑制2-苯基苯并咪唑-5-磺酸在提取过程中的离子化，增加回收率，同时中等极性的乙酸乙酯溶剂可以减少土壤中干扰物的过分提取，减少了方法的基质干扰，提高了灵敏度。
(2)土壤基质复杂，为了方法的基质干扰，本发明使用自制的硅胶层析柱净化，先使用正己烷洗脱非极性杂质，再用乙酸乙酯洗脱目标化合物2-苯基苯并咪唑-5-磺酸，达到净化目的，进一步提高了方法灵敏度。
(3)本发明使用内标法定量，经过仪器条件优化后，选用的内标物2-甲基-4-氯戊氧基丙酸和目标化合物在仪器中峰型良好，保留时间相近，并且在萃取前加入到样品中，抵消了目标化合物在萃取过程中损失所造成的误差，多次实验中都取得了良好的回收率。
(4)我国目前对土壤环境中的2-苯基苯并咪唑-5-磺酸关注较少，由于土壤环境基质复杂，常规分析方法干扰严重，造成分析困难，其分析检测技术尚处于技术空白。本发明从提取、净化和仪器分析方面提供了一套土壤中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的检测技术，平均回收率为91.8％～92.1％，检出限为0.19～0.22ng/g，定量限为0.64～0.74ng/g，适用于土壤中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的分析检测。
本发明的有益效是建立一种高效快捷、灵敏度高的分析方法，用于土壤中痕量2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的定性定量检测
附图说明
图1为2-苯基苯并咪唑-5-磺酸(pbsa)和2-甲基-4-氯戊氧基丙酸(mecoprop)的特征离子流图。
五、具体实施方式
实施例1
(1)超声萃取
土壤样品采集100g，冷冻干燥并去除石块和植物组织等较大的杂质，研磨过0.90mm筛。称取5g土壤样品于带盖离心管中，滴加100μl1mg/l的内标物2-甲基-4-氯戊氧基丙酸工作溶液，待溶剂挥发；加入10ml乙酸乙酯和甲酸混合溶剂(体积比50:1)，拧紧盖子，涡旋混合30s，超声萃取15min，2500rpm离心15min，吸取上层清液于梨形烧瓶中，再重复提取2次，合并萃取液于梨形烧瓶中，45℃旋转蒸发至干。
(2)硅胶层析柱净化
在玻璃层析柱底部装入少量玻璃棉，依次加入1g硅胶和0.5g无水硫酸钠，轻敲玻璃柱平整表面，依次加入10ml甲醇、10ml乙酸乙酯和10ml正己烷活化硅胶柱，注意过程中液面不能低于无水硫酸钠上界面。往梨形烧瓶中加入2ml正己烷重新溶解，并将溶液转移至硅胶层析柱中，弃去流出液，再重复步骤2次；往梨形烧瓶中加入2ml乙酸乙酯重新溶解，并将溶液转移至硅胶层析柱中，用玻璃管接收流出液，再重复步骤2次，合并流出液，于氮吹仪中吹干。往玻璃管中加入1ml甲醇重新溶解，过滤后，以2ml棕色进样小瓶中保存待测。
(3)标准工作溶液配制
用分析天平称取2-苯基苯并咪唑-5-磺酸和2-甲基-4-氯戊氧基丙酸的标准物质，分别用甲醇配制成100mg/l储备溶液并稀释成1mg/l工作溶液，最后配制成浓度为1、5、10、20、50、100和200μg/l的标准工作溶液，其中内标物浓度为100μg/l。
(4)高效液相色谱质谱联用仪检测
将梯度浓度的标准工作溶液在高效液相色谱质谱联用仪中测定，使用内标法建立标准工作曲线。在相同条件下将步骤(2)中的样品溶液注入高效液相色谱质谱联用仪中进行测定，将样品中目标化合物的色谱峰面积代入标准工作曲线，得到样品中pbsa的定性定量结果。
定性鉴定：在相同仪器条件下，若样品中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的色谱峰保留时间与标准工作溶液中的保留时间相一致，并且定性和定量离子对的丰度比与标准溶液一样，则可判断样品中存在2-苯基苯并咪唑-5-磺酸。
定量分析：以内标法建立标准工作曲线，线性范围0～200μg/l，标准曲线相关系数>0.999，通过软件计算样品溶液中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的浓度，最后按样品量计算样品中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的浓度。
加标回收率、重复性和基质效应：
回收率采用3次平行加标，加标方法为：在5.0g土壤样品中加入100μl1mg/l2-苯基苯并咪唑-5-磺酸标准溶液，使得样品中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的浓度为20ng/g，等待30min，溶剂挥发完全后，进行提取和检测。将实际测定的加标样品浓度减去空白样品浓度，并与理论添加浓度进行比较，得到2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的回收率，以3个平行加标结果的标准偏差表示方法重复性。基质效应按以下方法测试：将空白样品提取和浓缩至1ml后，取100μl的样品溶液于进样小瓶中，在氮吹仪上吹干，加入100μl浓度分别为100μg/l的2-苯基苯并咪唑-5-磺酸和2-甲基-4-氯戊氧基丙酸的混合标准溶液，旋涡混合均匀，上机检测。将实际测定的加标样品浓度减去空白样品浓度，并与理论添加浓度进行比较，得到方法的基质效应结果。方法的加标回收率、重复性和基质效应结果见表3所示，可以看出，土壤中加标浓度为20ng/g的情况下，2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的平均回收率为91.8％，标准偏差为1.4％，基质效应为92.2％，说明方法回收率和重复性好、基质干扰低，可用于土壤样品的检测。
检出限和定量限：
信噪比为3时对应的浓度为检出限，信噪比为10时对应的浓度为定量限，具体操作为：通过数据处理软件计算出加标浓度下的信噪比，用该加标浓度除以信噪比，该结果的3倍为方法检测限，10倍为定量限。方法的检出限和定量限结果如表3所示，可以看出，土壤中加标浓度为20ng/g的情况下，2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的检出限为0.19ng/g，定量限为0.64ng/g，说明本检测方法灵敏度高，可用于土壤样品中痕量2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的检测。
表3方法回收率、基质效应、检出限和定量限
a平均值±标准偏差(％)(n＝3)；b平均值±标准偏差(％)(n＝3)；c(ng/g)；d(ng/g)
实施例2
(1)超声萃取
土壤样品采集100g，冷冻干燥并去除石块和植物组织等较大的杂质，研磨过0.90mm筛。称取10g土壤样品于带盖离心管中，滴加100μl1mg/l的内标物2-甲基-4-氯戊氧基丙酸工作溶液，待溶剂挥发；加入10ml乙酸乙酯和甲酸混合溶剂(体积比100:1)，拧紧盖子，涡旋混合30s，超声萃取15min，2500rpm离心15min，吸取上层清液于梨形烧瓶中，再重复提取2次，合并萃取液于梨形烧瓶中，45℃旋转蒸发至干。
(2)硅胶层析柱净化
在玻璃层析柱底部装入少量玻璃棉，依次加入1g硅胶和0.5g无水硫酸钠，轻敲玻璃柱平整表面，依次加入10ml甲醇、10ml乙酸乙酯和10ml正己烷活化硅胶柱，注意过程中液面不能低于无水硫酸钠上界面。往梨形烧瓶中加入2ml正己烷重新溶解，并将溶液转移至硅胶层析柱中，弃去流出液，再重复步骤2次；往梨形烧瓶中加入2ml乙酸乙酯重新溶解，并将溶液转移至硅胶层析柱中，用玻璃管接收流出液，再重复步骤2次，合并流出液，于氮吹仪中吹干。往玻璃管中加入1ml甲醇重新溶解，过滤后，以2ml棕色进样小瓶中保存待测。
(3)标准工作溶液配制
用分析天平称取2-苯基苯并咪唑-5-磺酸和2-甲基-4-氯戊氧基丙酸的标准物质，分别用甲醇配制成100mg/l储备溶液并稀释成1mg/l工作溶液，最后配制成浓度为1、5、10、20、50、100和200μg/l的标准工作溶液，其中内标物浓度为100μg/l。
(4)高效液相色谱质谱联用仪检测
将梯度浓度的标准工作溶液在高效液相色谱质谱联用仪中测定，使用内标法建立标准工作曲线。在相同条件下将步骤(2)中的样品溶液注入高效液相色谱质谱联用仪中进行测定，将样品中目标化合物的色谱峰面积代入标准工作曲线，得到样品中pbsa的定性定量结果。
定性鉴定：在相同仪器条件下，若样品中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的色谱峰保留时间与标准工作溶液中的保留时间相一致，并且定性和定量离子对的丰度比与标准溶液一样，则可判断样品中存在2-苯基苯并咪唑-5-磺酸。
定量分析：以内标法建立标准工作曲线，线性范围0～200μg/l，标准曲线相关系数>0.999，通过软件计算样品溶液中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的浓度，最后按样品量计算样品中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的浓度。
加标回收率、重复性和基质效应：
回收率采用3次平行加标，加标方法为：在10.0g土壤样品中加入100μl1mg/l2-苯基苯并咪唑-5-磺酸标准溶液，使得样品中2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的浓度为10ng/g，等待30min，溶剂挥发完全后，进行提取和检测。将实际测定的加标样品浓度减去空白样品浓度，并与理论添加浓度进行比较，得到2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的回收率，以3个平行加标结果的标准偏差表示方法重复性。基质效应按以下方法测试：将空白样品提取和浓缩至1ml后，取100μl的样品溶液于进样小瓶中，在氮吹仪上吹干，加入100μl浓度分别为100μg/l的2-苯基苯并咪唑-5-磺酸和2-甲基-4-氯戊氧基丙酸的混合标准溶液，旋涡混合均匀，上机检测。将实际测定的加标样品浓度减去空白样品浓度，并与理论添加浓度进行比较，得到方法的基质效应结果。方法的加标回收率、重复性和基质效应结果见表4所示，可以看出，土壤中加标浓度为10ng/g的情况下，2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的平均回收率为90.5％，标准偏差为1.2％，基质效应为91.1％，说明方法回收率和重复性好、基质干扰低，可用于土壤样品的检测。
检出限和定量限：
信噪比为3时对应的浓度为检出限，信噪比为10时对应的浓度为定量限，具体操作为：通过数据处理软件计算出加标浓度下的信噪比，用该加标浓度除以信噪比，该结果的3倍为方法检测限，10倍为定量限。方法的检出限和定量限结果如表4所示，可以看出，土壤中加标浓度为10ng/g的情况下，2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的检出限为0.22ng/g，定量限为0.74ng/g，说明本检测方法灵敏度高，可用于土壤样品中痕量2-苯基苯并咪唑-5-磺酸的检测。
表4方法回收率、基质效应、检出限和定量限
a平均值±标准偏差(％)(n＝3)；b平均值±标准偏差(％)(n＝3)；c(ng/g)；d(ng/g)
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。