一种白酒中未知真菌毒素的非靶向快速筛查方法与流程

本发明涉及一种白酒中未知真菌毒素的非靶向快速筛查方法，属于分析检测技术领域。

背景技术

真菌毒素(mycotoxin)是各种真菌在生长过程中产生的一些具有毒性的次级代谢产物，具有极强的毒性并且具有致癌、致畸、致突变的作用。可使动物呈现急性、亚急性和慢性中毒症状，属于高危险物质。真菌可以在农作物生长或储存过程中生长，产生的真菌毒素可能会污染人类食品和动物饲料，严重影响食品安全问题。目前已经发现了400多种真菌毒素，真菌毒素对食品的污染不仅对人畜的健康造成潜在威胁，而且极大的影响了食品的经济价值并引起食品贸易纠纷。

白酒在生产过程中存在各种各样的霉菌，如：黄曲霉、黑曲霉、红曲霉、毛霉、根霉等。主要来源于原料、大曲和生产环列。这些霉菌不仅具有产酶、产香以及糖化淀粉的作用，某些霉菌还可能会产生对人体有害的次级代谢产物即真菌毒素，如酒醅和大曲中经常存在的黄曲霉之于黄曲霉毒素。高粱等原料在生长和贮存期间也可能会因霉菌繁殖而积累真菌毒素(黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇等)。有学者从酿酒用中高温大曲中分离出了具有产毒能力的黄曲霉。也有学者从大曲、酒醅、黄水等检出了黄曲霉毒素bl和赭曲霉毒素a，但并不能确定原酒和成品酒中上述两种真菌毒素的存在情况。因此建立白酒中未知真菌毒素的非靶向快速筛查方法非常紧急且必要。

随着气相色谱-质谱联用(gc-ms)、液相色谱-质谱联用(lc-ms)等技术的普遍应用，农药多残留同时检测技术得到了迅速发展。以四极杆串联飞行质谱(q-tof)为代表的高分辨质谱具有分辨率高，精确质量数测定，全扫描下高灵敏度等优点，可对复杂基质中的化合物进行定性确认。由于q-tof具有高扫描速度，可不用考虑化合物数量上的限制，实现大量农药同时高通量的筛查。还可将化合物的精确质量数与保留时间、同位素强度、同位素分布、二级碎片等信息结合，与特定化合物数据库匹配实现真菌毒素的无标准品快速筛查。

但是白酒样品的基体复杂，含有两千多种微量成分，不仅会干扰目标物(农药化合物)的分析，而且会对色谱柱和质谱造成致命的损害，故如何有效提取目标物并净化去除白酒中的干扰杂质成为亟需解决的一个难题。

技术实现要素：

为了解决上诉问题，本发明提供了一种白酒中未知真菌毒素的非靶向快速筛查方法。本发明方法筛查分析白酒专属性强、操作简单、快速准确、分析种类丰富，可为白酒真菌毒素的快速分析和质量控制提供科学方法。

本发明采用真空浓缩除去乙醇，再经hlb固相萃取柱净化浓缩，uplc-q-tof检测，利用未知目标化合物特征离子峰的精确质量数、子离子碎片信息、同位素匹配、保留时间和数据库进行匹配，查找可疑的真菌毒素。

本发明白酒中未知真菌毒素的非靶向快速筛查方法，包括如下步骤：

步骤1：样品前处理

取白酒试样500ml于蒸发瓶中，蒸发温度40℃，转速120r/min，旋蒸浓缩至200ml，取出备用；取3ml甲醇活化于hlb固相萃取柱，再用3ml超纯水平衡柱子，将旋蒸至200ml的白酒试样以5ml/min的速度连续通过活化的固相萃取柱，然后用2ml去离子水淋洗，抽真空干燥固相萃取小柱5min，弃去流出液，最后用5ml甲醇洗脱小柱，收集洗脱液，即为待测液；

步骤2：uplc-q-tof检测

将待测液通过超高效液相色谱系统对真菌毒素化合物进行分离，采用配有电喷雾离子源的uplc-q-tof，分别采用ms^e的es+和es-两种模式进行采集，对真菌毒素化合物进行检测；

步骤3：农药筛查

采用ms^e模式同时采集样品母离子和子离子数据信息，结合unfi软件使用科学数据库对农药进行筛查，科学数据库根据准确的母离子质量、保留时间、碎片离子，以及同位素模型及强度进行鉴定，获得未知组分(m/z)的信息。

步骤2中，uplc-q-tof检测的检测参数为：

色谱条件：

色谱柱：acquityuplcbenc18column，2.1mm×100mm，1.7μm；

流动相：流动相a为水，流动相b为乙腈，流速：0.4ml/min，梯度洗脱；

梯度洗脱程序设置如下：

0～0.5min：95％a+5％b；0.5～5.5min：5％a+5％b；5.5min～6.5min：5％a+95％b；6.5～6.6min：95％a+5％b；6.6～10min：95％a+5％b。

进样量：5μl；

柱温：30℃；

质谱条件：g2-sqtof质谱仪；采集模式：mse模式；esi+电离模式条件：毛细管电压：3.0kv；取样锥孔电压：40v；离子源温度：120℃；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气体流速：1000l/h；参比质量：亮氨酸脑啡呔[m+h]⁺＝556.2766；esi-电离模式条件：毛细管电压：2.5kv；取样锥孔电压：40v；离子源温度：120℃；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气体流速：1000l/h；参比质量：亮氨酸脑啡呔[m-h]^-＝554.2615。采集范围：m/z50～1200；低能碰撞能量：4ev；高能渐变碰撞能量：10～45ev。

步骤3中，筛查参数为：保留时间检索范围为±0.02min，精确质量偏差为5mda，离子化形式选择+h和-h模式。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本发明采用选装蒸发-hlb为前处理方式，对真菌毒素回收率高、稳定性好，能够有效去除干扰物质，同时采用uplc-q-tof对白酒中真菌毒素进行快速无标准品定性筛查。

本发明方法快速和分析通量高，可以为白酒中真菌毒素的快速筛查和质量控制提供重要的方法依据。

附图说明

图1为玉米赤霉烯酮选择离子流图(a)和质谱图(b)。

图2为7种验证真菌毒素的es-总离子流图(a)和es+总离子流图(b)。

具体实施方式

为便于理解本发明，下面结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

1.1试剂、药品

真菌毒素标准物质(纯度>95％，上海安谱)，单标储备溶液(400ug/l)，由乙腈配置，-20℃避光保存。

1.2仪器设备

watersacquityi-class系统g2-xsqtof质谱仪配有电喷雾离子源(esi)；瑞士步琪r-210真空旋蒸蒸发仪；oasisprimehlbhlb固相萃取柱；

1.3样品前处理

取白酒试样500ml于蒸发瓶中，蒸发温度40℃，转速120r/min，旋蒸浓缩至200ml，取出备用；取3ml甲醇活化于hlb固相萃取柱，再用3ml超纯水平衡柱子，将旋蒸至200ml的白酒试样以5ml/min的速度连续通过活化的固相萃取柱，然后用2ml去离子水淋洗，抽真空干燥固相萃取小柱5min，弃去流出液，最后用5ml甲醇洗脱小柱，收集洗脱液，即为待测液，供uplc-q-tof检测；

1.4uplc-q-tof检测

待测液通过液相色谱系统进行分离，色谱条件：色谱柱：acquityuplcbenc18column，2.1mm×100mm，1.7μm；流动相：a相水，b相为乙腈，流速：0.4ml/min，梯度洗脱；0～0.5min：95％a+5％b；0.5～5.5min：5％a+5％b；5.5min～6.5min：5％a+95％b；6.5～6.6min：95％a+5％b；6.6～10min：95％a+5％b；进样量：5μl；柱温：30℃；质谱条件：g2-sqtof质谱仪，采集模式：ms^e模式；esi+电离模式条件：毛细管电压：3.0kv；取样锥孔电压：40v；离子源温度：120℃；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气体流速：1000l/h；参比质量：亮氨酸脑啡呔[m+h]+＝556.2766。esi-电离模式条件：毛细管电压：2.5kv；取样锥孔电压：40v；离子源温度：120℃；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气体流速：1000l/h；参比质量：亮氨酸脑啡呔[m-h]-＝554.2615。采集范围：m/z50～1200；低能碰撞能量：4ev；高能渐变碰撞能量：10～45ev。

1.5筛查方法：采用ms^e模式，分别采集es+和es-电离模式下的母离子和子离子数据信息，以不含真菌毒素的超纯水作为对照，结合unfi软件使用科学数据库对农药进行筛查，科学数据库根据准确的母离子质量、保留时间、碎片离子，以及同位素模型及强度进行鉴定，快速评估未知组分(m/z)的信息。

2结果与讨论

2.1样品前处理方法的回收率与稳定性

白酒样品的基体复杂，含有两千多种微量成分，不仅会干扰目标物(农药化合物)的分析，而且会对色谱柱和质谱造成致命的损害，故如何有效提取目标物并净化去除白酒中的干扰杂质成为亟需解决的一个难题。本实验先采用真空浓缩去除白酒中中的绝大部分乙醇，再通过oasisprimehlbhlb固相萃取柱净化提取，再对该方法的准确性和重复性进行了评价，以玉米赤霉烯酮为例，es-电离模式下出峰时间为3.67min，二级质谱图符合+h模式，具体见图1(a为选择离子流图、b为质谱图)，在100、200和400ug/l添加水平下，回收率在90％～110％范围内，并且rsd<10％(n＝5)。实验结果说明前处理方法的准确性和重复性良好，可应用于白酒中真菌毒素多残留的筛查与检测。

2.2检出参数的优化

本方法筛查采用不含真菌毒素的超纯水作为对照组，可去除显著假阳性结果，还包括保留时间检索范围为±0.02min，精确质量偏差为5mda，离子化形式选择+h和-h模式。

2.3非靶向快速筛查真菌毒素的验证方法

7种验证真菌毒素aflatoxinb1、aflatoxinb2、aflatoxinm1、aflatoxinm2、deoxynivalenol、ochratoxina、zearalenone在1.4实验条件下进行实验，其总离子流图见图2，设定筛选工作流有源内裂解、相应值大于8000且误差小于2mda，结果见下表。实验结果表明，本发明所所采用的uplc-q-tof系统以及相关农药数据库、筛选软件、保留时间锁定等技术，能准确可靠地实现白酒中真菌毒素筛选。