专利名称：△4去饱和酶及其在制备多不饱和脂肪酸中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。更具体地讲，本发明涉及编码Δ4脂肪酸去饱和酶的 核酸片段的鉴定以及这种去饱和酶在制备长链多不饱和脂肪酸[“PUFA”]中的用途。
背景技术：
已经有大量文献证明了与多不饱和脂肪酸[“PUFA” ]，尤其是ω -3和ω -6 PUFA 相关的健康有益效果。为了寻找大规模制备ω-3和《-6PUFA的方法，研究者已经将他们 的工作转向发现基因以及了解产生脂质和脂肪酸的编码的生物合成途径。人们正研究包括植物、藻类、真菌、原生藻菌(stramenopiIes)和酵母在内的多种 不同宿主作为商业化PUFA生产的手段。基因工程已经证明基本上能改变一些宿主，甚至那 些天然生产亚油酸[“υν”；18:2ω-6]或α -亚麻酸[“ALA” ； 18 3 ω-3]脂肪酸受限的宿 主的天然能力以生产高水平的多种长链ω-3/ω-6 PUFA。不管这是天然能力还是重组技术 的结果，从二十二碳五烯酸[“DPA”;22:5co-3]生产二十二碳六烯酸[“DHA” ;226 ω-3] 可能需要表达Δ 4去饱和酶。更具体地讲，迄今鉴定的大多数Δ 4去饱和酶具有将DPA转 化成DHA的主要能力，以及将二十二碳四烯酸[“DTA”;22:4 -6]转化成ω-6 二十二碳五 烯酸[“DPAn-6”;22:5co-6]的次要活性。基于Δ4去饱和酶在合成DPA中的作用，已经付出了相当大的努力来鉴定和表 征来自多种来源的这些酶。已经在公开文献和专利文献中公开了多种Δ4去饱和酶。一 些实例包括小眼虫(Euglena gracilis) (SEQ ID NO :13 ;GenBank 登录号 AY278558 ； Meyer 等人，Biochemistry,42 (32) :9779_9788 (2003))；假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana) (SEQ ID NO 37 ；GenBank 登录号 AAX14506 ；Tonon 等人，^BS J.，272 (13) 3401-3412(2005))；金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum) (SEQ ID NO 14 ；GenBank 登录号 AAN75707)；破囊壶菌属物种(Thraustochytrium sp.) (GenBank 登录号 CAD42496 ； 美国专利 7,087,432)；聚合裂殖壶菌(Schizochytrium aggregatum) (SEQ ID NO 41 ； H 际申请公布 WO 2002/090493)；鲁兹巴夫藻(Pavlova lutheri) (SEQ ID NO 42 ；GenBank 登录号 AAQ98793)；和球等鞭金藻(Isochrysis galbana) (SEQ ID NO 43 ；GenBank 登 录号 AAV33631 ；Pereira 等人，Biochem. J.，384 (2) :357_366 (2004)；国际申请公布 WO 2002/090493)。因此，需要鉴定和分离另外的编码Δ 4去饱和酶的基因，该基因将适于在多 种宿主生物体中异源表达以用于产生ω-3/ω-6脂肪酸。申请人:已通过从小型绿藻属cf_gymnastica CCMP1594中分离编码Δ 4脂肪酸去 饱和酶的基因解决了所述问题。发明简述本文所述的是编码具有△ 4去饱和酶活性的多肽的新基因构建体，以及它们在藻 类、细菌、酵母、类眼虫、原生藻菌(Stramenopiles)、真菌、植物和动物中生产多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的用途。本文所述的是分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自(a)编码选自SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4的Δ 4去饱和酶的分离的核苷酸序 列；(b)在如下杂交条件下与(a)杂交的分离的核苷酸序列0. 1XSSC、0. 1%SDS,65°C 以及用2X SSC,0. 1% SDS洗涤，之后用0. IX SSC,0. 1% SDS洗涤；和(c)与(a)或(b)完全互补的分离的核苷酸序列。本文所述的其他分离的核酸分子包含第一核苷酸序列或第二核苷酸序列，所述第 一核苷酸序列编码至少514个氨基酸的Δ 4去饱和酶，所述Δ 4去饱和酶基于Clustal W 比对方法在与具有如SEQ ID NO :2所示的序列的多肽进行比较时具有至少68%的同一性； 所述第二核苷酸序列包含所述第一核苷酸序列的互补序列。本文还描述了本文所述的核酸分子的遗传嵌合体和包含它们的转化过的宿主细 胞。此外，本文还描述了生产二十二碳六烯酸的方法，所述方法包括a)提供宿主细胞，其包含(i)编码Δ4去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，所述Δ4去饱和酶多肽基于 Clustal W比对方法在与具有如SEQ IDNO :2所示的氨基酸序列的多肽进行比较时具有至 少68%的同一性；和(ii)全-顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22:5，ω 3)的源；b)使步骤(a)的宿主细胞在表达所述编码Δ 4去饱和酶多肽的核酸片段并且将所 述全-顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22:5，ω-3)转化成二十二碳六烯酸的条件 下生长；和c)任选地回收步骤(b)的二十二碳六烯酸。同样，提供了生产全-顺式-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5，ω-6)的方 法，所述方法包括a)提供宿主细胞，其包含(i)编码Δ4去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，所述Δ4去饱和酶多肽基于 Clustal W比对方法在与具有如SEQ IDNO :2所示的氨基酸序列的多肽进行比较时具有至 少68%的同一性；和(ii) 二十二碳四烯酸源；b)使步骤(a)的宿主细胞在表达所述编码Δ 4去饱和酶多肽的核酸片段并且将所 述二十二碳四烯酸转化成全-顺式-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5，ω-6)的条件 下生长；和c)任选地回收步骤(b)的全-顺式-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5， ω -6) ο生物保藏下述生物材料将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条 约的有关条款来制备。
权利要求
分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自(a)编码选自SEQ ID NO2和SEQ ID NO4的Δ4去饱和酶的分离的核苷酸序列；(b)在如下杂交条件下与(a)杂交的分离的核苷酸序列0.1XSSC、0.1％SDS，65℃以及用2X SSC、0.1％SDS洗涤，之后用0.1X SSC、0.1％SDS洗涤；(c)与(a)或(b)完全互补的分离的核苷酸序列；和(d)包含第一核苷酸序列或第二核苷酸序列的分离的核酸分子，所述第一核苷酸序列编码至少514个氨基酸的Δ4去饱和酶，所述Δ4去饱和酶基于Clustal W比对方法在与具有如SEQ ID NO2所示的序列的多肽进行比较时具有至少68％的同一性；所述第二核苷酸序列包含所述第一核苷酸序列的互补序列。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中至少191个密码子经密码子最优化以便在耶氏 酵母属中表达。
3.权利要求1的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自SEQIDNO :1和SEQ ID NO:3。
4.编码Δ4去饱和酶的多肽，所述Δ 4去饱和酶选自SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :4。
5.包含权利要求1的分离的核酸分子的嵌合基因，所述分离的核酸分子可操作地连接 至至少一种调控序列。
6.宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求1的分离的核酸序列并且优选选自酵母；优 选选自耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂 酵母属的含油酵母；藻类；细菌；类眼虫；原生藻菌；真菌和优选选自大豆、谷物、亚麻、油菜 籽、报春花、卡诺拉、玉米、棉花、红花、和向日葵的植物。
7.包含权利要求1的分离的核酸分子的转化过的耶氏酵母属物种。
8.制备多不饱和脂肪酸的方法，所述多不饱和脂肪酸选自二十二碳六烯酸和全_顺 式-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5，w-6)，所述方法包括a)提供宿主细胞，所述宿主细胞包含(i)编码Δ4去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，所述Δ 4去饱和酶多肽基于Clustal W比对方法在与具有如SEQ IDNO 2所示的氨基酸序列的多肽进行比较时具有至少68%的 同一性；和(ii)选自全-顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22:5,w-3)和二十二碳四烯酸 的源脂肪酸；b)使步骤(a)的宿主细胞在表达编码所述△4去饱和酶多肽的核酸片段并且将所述源 脂肪酸转化成选自全-顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22:5，w-3)和二十二碳四 烯酸的多不饱和脂肪酸的条件下生长，使得当全-顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22:5，w-3)是所述源脂肪酸时，则 二十二碳六烯酸是所产生的多不饱和脂肪酸；并且当二十二碳四烯酸是所述源脂肪酸时，则全-顺式-4，7，10，13，16- 二十二碳五烯酸 (22:5, w-6)是所产生的多不饱和脂肪酸；和c)任选地回收步骤(b)中产生的多不饱和脂肪酸。
9.权利要求8的方法，其中所述分离的核酸分子编码具有选自SEQIDNO :2和SEQ ID NO 4的氨基酸序列的Δ 4去饱和酶多肽。
10.权利要求9的方法，其中a.)所述分离的核酸分子具有选自SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3的核酸序列；并且宿 主细胞选自藻类；细菌；酵母；优选选自耶氏酵母属、假丝酵母属、红酵母属、红冬孢酵母 属、隐球酵母属、丝孢酵母属和油脂酵母属的含油酵母；原生藻菌；类眼虫；真菌；植物细胞 和动物细胞。
全文摘要
本文所述的是Δ4去饱和酶，所述酶将全-顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸[“DPA”；22:5ω-3]转化成二十二碳六烯酸[“DHA”；22:6ω-3]并且具有将二十二碳四烯酸[“DTA”；22:4ω-6]转化成全-顺式-4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸[“DPAn-6”；22:5ω-6]的次级活性。本文还描述了分离的核酸片段和包含此类编码Δ4去饱和酶的片段的重组构建体以及使用含油酵母中的所述Δ4去饱和酶制备长链多不饱和脂肪酸[“PUFA”]的方法。
文档编号A01H5/00GK101980595SQ200980110595
公开日2011年2月23日 申请日期2009年4月1日 优先权日2008年4月2日
发明者Q·Q·朱, Z·薛 申请人:纳幕尔杜邦公司