专利名称：根特异性启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及根部特异表达启动子，其克隆、功能验证其应用。
背景技术：
花生是中国重要的油料作物和经济作物，2011年，我国的花生种植面积为470万公顷，产量为1620万吨，居世界首位，占世界花生产量的47. 9%(USDA, World AgriculturalProduction, United States Department of Agriculture, 2010)。随着中国大豆面积逐年萎缩，“优化食用油结构，发展花生产业，保证中国食用油战略安全”的呼声越来越高，花生病虫害防治和品质改良应给予足够的重视。花生的品质及产量易受地下害虫、真菌及细菌病害的影响(Vargas Gil S，Haro R, Oddino C，et al. Crop managementpractices in the control of peanut diseases caused by soilborne fungi. CropProtection, 2008, 27:1_9.)，尽管传统的杂交育种可以得到一些抗虫抗病的花生品系(Garcia G,Tallury S，Stalker H, et al. Molecular analysis of Arachis interspecifichybrids. Theoretical and Applied Genetics, 2006，112:1342-1348.),但是花生栽培品种遗传多样性低(Kochert G, Halward T, Branch W D, et al. RFLP variabilityin peanut (Arachis hypogaea L.)cultivars and wild species [J].Theor ApplGenet, 1991，81:565-570.)，杂交育种周期长，育成的抗病性状通常与其他非预期的性状连锁，因此，借助基因工程育种技术培育花生品种，改良花生品质具有明显的优势。组织特异性启动子，可以避免蛋白合成的浪费，使基因只在某些特定的器官或组织中表达。目前相继发现的组织特异性启动子主要有根部特异、果实特异、维管组织特异、花粉管特异、韧皮部特异、种子特异和块茎特异等组织特异启动子，是研究基因功能及表达特性的重要工具，尤其在植物基因工程育种中发挥重要作用。根是植物体的重要器官，除了吸收土壤中的水分及养分、贮存合成有机物质，还和土壤中的微生物有密切的互作关系。花生根系容易受蛴螬等地下害虫的啃食，继而感染根腐病、茎腐病等细菌真菌病害的几率增加，造成部分产区的减产绝收。花生抗病虫基因工程的研究已经在我国陆续的展开，克隆根部特异表达启动子，对于保证抗病虫外源基因在花生根中特异、稳定、高效表达及增加转基因生物安全性具有重要意义。目前已克隆到的植物根特异性启动子主要在拟南芥、水稻、烟草、大豆、玉米、松树、胡萝卜、番茄中，这些启动子驱动的基因多与根系分泌、次生代谢有关，花生根特异性启动子在国内外还未见报道。随着新一代测序技术454、Solexa高通量测序的诞生，测序成本大幅度降低，这直接促进了数字基因表达谱(Digital gene expression profile)技术的发展。该技术可以快速地检测某一物种特定组织在特定时期的基因表达情况，并将表达水平数字化，突破传统的mRNA差异显示PCR、代表性差异分析、抑制性消减杂交等基因表达差异分析方法样品用量大、操作繁琐、假阳性高的弱点。Solexa高通量测序的核心技术是DNA “簇”和“可逆性末端终止”，通过对样本中数以百万的EST同时进行序列测定，Genome Analyzer系统可以对整个转录组进行数字化的分析。无需设计特异性杂交探针及基因组的注释信息，可以同时进行全基因组转录子的发掘与定量分析。采用边合成边测序的方法，反应可以同时检测上亿个核苷酸片段，比芯片技术效率高、成本低。
发明内容
本发明提供一种根特异表达启动子，确保外源基因在根部特异、稳定表达，对于植物根部病虫害防治具有重要的意义。一种根特异表达启动子AhRootSP，具有如SEQ ID NOl所示的核苷酸序列。一种表述载体，其含有上述根特异表达启动子。所述表述载体为pRGFP或pRGUSplus,如图I中所述。根特异表达启动子AhRootSP的应用，为将含有转化基因的表达载体转化植物，使转化基因在根部特异表达。所述植物为花生，拟南芥或烟草。所述转化基因为具有杀虫效果的外源基因。本研究利用Illumina公司Solexa技术对花生根、幼胚及叶片转录组测序,构建基因数字表达谱，结合半定量RT-PCR快速对数字表达谱结果进行验证，确定根部特异表达基因。通过Genome walking方法获得该基因的启动子序列，并通过根癌农杆菌介导的遗传转化系统验证了 AhRootSP启动子的功能，发现由该启动子驱动的基因在拟南芥、烟草和花生的根部特异表达。
图I植物表达载体构建流程2不同PCR循环数时扩增18SrDNA结果M DM2000 分子量(2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp) ;1 :阴性对照CddH2O)；2-6 ;分别为循环数为10、15、20、25和30时18SrDNA的扩增结果；图3不同PCR循环数时扩增18SrDNA结果M DM2000 分子量(2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp) ;7 :阴性对照CddH2O)；8-13 :分别为循环数为20、21、22、23、24和25时18SrDNA的扩增结果图4不同组织扩增18S rDNA的内参调平结果图5根部特异表达候选EST的RT-PCR验证结果图6AhSymRK上游序列的获得A =AhSymRK上游序列的基因组步移结果，B :以DNA为模板扩增ATG上游序列的结果;M1、M2 DL2000DNA marker ;1_3 :分别为以 Dra I ,EcoR V和 Pvu II 酶切的 DNA 库为模板的PCR扩增产物；4-5 560bp的ATG上游序列扩增产物图7PAhSymRK启动子区核酸序列分析 今今了启动子中的增强子区域TCA-element:水杨酸应答元件；ATATTbox根特异表达元件；CNAATG motif :组织特异性转录因子结合位点图8pRGFP 及 pRGUSplus 酶切鉴定Ml BM10000Marker ；M2 DM2000Marker ；1 pRGFP ；2 pRGUSplus图9转化农杆菌LBA4404的PCR鉴定M DM2000Marker ；1 :负对照(ddH20) ；2 :阳性对照(plasmid DNA) ;3_6 p2300GFP转化农杆菌的PCR检测结果；7-11 :p2300⑶Splu转化农杆菌的PCR检测结果图10烟草的遗传转化A :叶盘；B :诱导芽；C :抗性芽伸长D :抗性芽生根图11烟草抗性苗的GFP观察A、C和E :明场;B、D和F :暗场A和B :两片叶展开；C和D 4片叶展开；E和F :生长旺盛期图12拟南芥的⑶S染色鉴定A :真叶期；B :幼苗；C :抽薹；D :莲座叶图13花生的遗传转化A :去胚子叶；B :诱导芽；C和D :抗性芽伸长；E和F :抗性芽生根图14花生抗性苗的⑶S染色鉴定A :对照植株(未侵染含根特异表达启动子载体)；B :抗性植株(载体pRGUSplus)；C :抗性植株叶片；D :抗性植株根部
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。材料和方法I.材料I. I质粒及菌株基础载体pCAMBIA2300、克隆菌株DH5a和根癌农杆菌为LBA4404均为本实验室保存，可以对外公开发放。I. 2植物材料供试栽培花生(Arachis hypogaea L.)品种白沙1016由山东省花生研究所提供，烟草(Nicotiana benthamiana)和野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚(Columbia)生态型为本实验室保存，可以对外公开发放。I. 3 试剂Ex-Taq高保真聚合酶、T4DNA连接酶及限制性内切酶等购自TaKaRa公司；2XTaqMixPCR购自北京博迈德生物技术公司；质粒小量提取试剂盒、DNA回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒等购自Axygen公司；其他均为市售国产、进口分析纯试剂。I. 4DNA 分子量λ/EcoR130 I :19329bp、7743bp、6223bp、4254bp、3472bp、2690bp、1882bp、1489bp、925bp ；DM2000 :2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp、50bp。2 方法
2. I候选EST表达特性的RT-PCR验证2. I. I花生各组织RNA的提取及反转录成第一条链cDNATRizol法提取花生根、莖、叶和幼胚的总RNA,反转录体系在O. 2ml RNase-freeEP管中，取约Iyg的RNA加入0.5yL oligo d(T)25，混均，70°C 4min使RNA的二级结构打开，迅速置于冰上，5分钟后待混合物彻底冷却，加入4μ L5XM-MLV Buffer, I μ LdNTP (2. 5mMeach), 2 μ L RNase Inhibitor, I μ LM-MLV 反转录酶，RNase-free ddH20 补至20 μ L,混均后于 PCR 仪中 42°C 90min, 72°C 7min, 4°C终止。2. I. 2内参基因调平I)先确定18S rDNA进入平台期的循环范围以18S rDNA作为内参基因，扩增产物长度400bp，引物序列如下18SF :5’-GAAACGGCTACCACATCCAAG-3’18SR :5’-CCAACCCAAGGTCCAACTACG-3’PCR 反应体系25μ 2 X taq Mix (Promega), I. 5 μ L 18 S-F Primer (10 μ mol/L)，I. 5 μ L18S-R Primer (10 μ mol/L)，I μ L 根 cDNA 作为模板，ddH20 补足体积 50 μ L。PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性30s，61°C退火lmin,30个循环，分别在10、15、20及25循环时处分别取出5μ L保存，全部程序运行结束后，进行电泳检测，并用ImageJ软件分析电泳结果。2)确定18S rDNA进入平台期的具体循环数PCR反应体系同上，PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性30s，61°C退火Imin, 25个循环，在每一个循环时处分别取出5 μ L保存，共取样5次，全部程序运行结束后，进行电泳检测，并用ImageJ软件分析电泳结果。3) 18S rDNA扩增不同组织的cDNA进行内参基因调平反应体系及条件同上，模板为根、茎、叶和幼胚的cDNA，循环数为步骤(2)中确定的结果，PCR结束后各取5 μ L进行电泳检测，并用ImageJ软件分析电泳结果。通过稀释模板来调平内参基因的亮度，直至内参基因亮度一致。2. I. 3花生根特异性表达候选EST的RT-PCR验证根据筛选到的根特异表达候选EST序列设计引物，见表I。表IRT-PCR验证根部特异表达候选EST引物序列
Contig编号上游引物(5’-35)F游引物(5’-3，)产物长度236389TGCCAATGTTTTGAGTTTACTGCGCATCTGATTAAC386模板为经调平浓度后的根、茎、叶和幼胚cDNA，PCR反应体系同上，反应条件94°C预变性 5min，94°C变性 30s，58。。退火 Imin, 30 个循环，72°C IOmin02. 2根部特异表达启动子的克隆2. 2. ICTAB法提取花生基因组I)称取0. 4g的花生叶片放入I. 5ml的离心管，用液氮研磨，迅速加入500 μ I预热至 65 的 2XCTAB 提取缓冲液(2% CTAB，100mM Tris *Cl,50mM EDTA, I. 4M NaCl，pH 8. O,使用之前加0. I %巯基乙醇)，颠倒混匀，置于65°C水浴温浴lOmin。2)取出离心管，加入等体积的氯仿:异戊醇(24 :1)，12，OOOrpm室温离心IOmin03)轻轻吸取上清，加入0. 6倍体积的异丙醇，充分混匀，放置IOmin沉淀基因组。
4) 4°C，12，OOOrpm离心lOmin，弃去残液，用70%乙醇洗涤两次，真空干燥DNA后，加入35 μ I无菌CldH2O溶解，-20°c保存备用。2. 2. 2 花生 DNA “library” 的构建I)人工接头的制备浓度为 50 μ mol/L Long-Adaptor 和 Short-Adaptor 在Tris-HCl缓冲液(250ymol/L，pH 7. 5)中退火，退火条件如下95°C变性5min，然后2h内逐步降到室温，室温放置Ih后4°C过夜。接头和引物的合成由上海生工生物技术有限公司完成，引物见表2-1。表2引物名称及序列
权利要求
1.一种根特异表达启动子AhRootSP，具有如SEQ ID NOl所示的核苷酸序列。
2.—种表述载体,其含有上述根特异表达启动子。
3.如权利要求2所述的表述载体，其为pRGFP或pRGUSplus，如图I中所述。
4.根特异表达启动子AhRootSP的应用，为将含有转化基因的表达载体转化植物，使转化基因在根部特异表达。
5.根据权利要求4所述的应用，所述植物为花生，拟南芥或烟草。
6.根据权利要求4或5所述的应用，所述转化基因为具有杀虫效果的外源基因。
全文摘要
本发明涉及根特异性启动子及其应用，属于生物技术领域。根特异表达启动子，具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本发明在花生根部克隆得到该根特异表达启动子，实验证明，该启动子驱动的基因在拟南芥、烟草和花生的根部特异表达。该根部特异表达启动子对于植物根部病虫害防治具有重要的意义。
文档编号A01H5/00GK102911941SQ20121043351
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月2日 优先权日2012年11月2日
发明者张 杰, 耿丽丽, 段晓红, 束长龙, 宋福平, 彭琦 申请人:中国农业科学院植物保护研究所